伪三元相图结合CCD 响应面法优化辛夷油微乳处方*

黄 琼，李媛媛，石锦峰，许锦涛，董自波，2△

（1. 江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005； 2. 江苏省海洋药用资源开发工程研究中心，江苏 连云港 222005）

辛夷具有散风寒、通肺窍功效，主治风寒头痛、鼻塞、鼻渊、鼻流浊涕等症，其药用成分主要集中于挥发油中［1］。微乳（ME）是油相、水相、乳化剂、助乳化剂按一定比例混合，自发形成的各向同性、热力学稳定的体系，粒径为10～100 nm，可提高水难溶性及脂溶性药物的溶解度，粒径小且分布均匀，提高生物利用度，增强稳定性，且存储方便［2-3］。将挥发油与一定比例的乳化剂与助乳化剂制成水包油型微乳（O/W），可改善前者的溶解性，使其在体内维持恒定有效的血药浓度［4-5］。中心复合设计（CCD）响应面法集数学和统计学方法为一体，具有显著优势［6］。本研究中采用伪三元相图法［7］联合CCD响应面法筛选和优化辛夷油微乳处方。现报道如下。

1 仪器及试药

1.1 仪器

JJ444BC 型电子分析天平（上海赛多利斯贸易有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度仪（英国Malvern公司）；KDM 型调温加热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）；ZNCL-GS 型智能磁力搅拌器（上海凌科实业发展有限公司）。

1.2 试药

聚氧乙烯醚蓖麻油（EL35，批号为L13056975）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40，批号为C13263123）、吐温80（TW80，批号为C11595187）、聚乙二醇400（PEG400，批号为C12919100），均购自上海麦克林生化科技公司；无水乙醇（批号为20200805）、甘油（批号为20191014），均购自国药集团化学试剂有限公司；辛夷药材饮片（亳州中药材总公司中西药公司，批号为20210320）。

2 方法与结果

2.1 辛夷油提取

采用水蒸气蒸馏法提取［8-10］。取药材样品50 g，置1 000 mL圆底烧瓶中，加入药材9倍量的水，浸泡0.5 h，以加热套加热回流提取挥发油，煮沸后调节电压至微沸，提取3 h，即得辛夷油。

2.2 乳化剂与助乳化剂初筛

将不同乳化剂、助乳化剂与油相按一定比例组合，观察乳化情况，初步筛选乳化剂与助乳化剂。固定乳化剂与助乳化剂比例（Km值）为1∶1，油相、乳化剂与助乳化剂混合液的总质量为1.0 g，制备乳化剂与助乳化剂总量（Ts）和乳化剂比例分别为7∶3，6∶4，5∶5 的混合液，混匀，缓慢加入35 ℃蒸馏水，磁力温和搅拌，稀释至10 mL。目测外观判断等级并记录。判断标准［11］：A，迅速乳化，形成澄清或泛蓝的微乳；B，迅速乳化，形成蓝白色微乳；C，分散乳化稍慢，形成白色乳剂；D，分散乳化较慢，油相与水相无法形成均一体系。结果显示，所选乳化剂与助乳化剂与油相均有一定相容性，但有些不能形成微乳。乳化剂EL35 所在体系乳化情况良好；RH40 与TW80 的混合液体系乳化较慢，遇水形成白色奶状乳剂。故确定乳化剂为EL35。助乳化剂为PEG400 或甘油所在体系乳化效果优于无水乙醇所在体系，故助乳化剂选用PEG400或甘油。结果见表1。

表1 油相、乳化剂与助乳化剂在不同比例下的乳化情况Tab.1 Emulsification of oil phase，emulsifier and co - emulsifier in different ratios

2.3 乳化剂筛选

以辛夷油为油相、EL35 为乳化剂，分别与助乳化剂PEG400、甘油组成三元系统绘制伪三元相图。固定Km值为1∶1，油相、乳化剂与助乳化剂混合液的总质量为1.0 g，Ts与油相的比例按9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 制备不同质量比例的混合物。按不同比例称取辛夷油、乳化剂与助乳化剂，置50 mL 小烧杯中，30 ℃下450 r/min 磁力搅拌，混匀，滴加蒸馏水，观察溶液由澄清变浑浊再变澄清的现象，待溶液澄清不再变化时记录滴加的水量。采用Origin 9.0软件连接可形成微乳的点，绘制伪三元相图，比较形成微乳的区域大小，选择助乳化剂。详见图1。在相同条件下，A 图中能形成微乳的面积较大，故选择PEG400作为助乳化剂。

A.PEG400 B. 甘油图1 不同助乳化剂绘制的伪三元相图A.PEG400 B.GlycerolFig.1 Pseudo- ternary phase diagram of different co- emulsifiers

2.4 CCD 响应面法优选［12-13］

以辛夷油为油相、EL35 为乳化剂、PEG400 为助乳化剂组成三元系统绘制伪三元相图。变换Km值，油相、Ts的总质量为1.0 g 时，Ts与油相的比例按9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 制备不同质量比例的混合物。按不同比例，称取辛夷油、乳化剂与助乳化剂，置50 mL 小烧杯中，30 ℃下450 r/min 磁力搅拌，混匀，滴加蒸馏水，观察溶液由澄清变浑浊再变澄清的现象，待溶液澄清不再变化时记录滴加的水量。用Origin 9.0 软件连接可形成微乳的点，绘制伪三元相图。结果见图2。可见，变换Km值为3∶1 时，稀释过程中会出现黏度大的凝胶相，形成微乳的时间变长，当Km值为1∶3 时，混合体系形成微乳的点极少，难以绘制伪三元相图。结果显示，不同Km值，混合体系能形成微乳的区域为油相质量分数在30%～60%范围内，因此选取对微乳粒径及聚合物分散性指数（PDI）有显著影响的2个因素［油相质量分数（X1）和Km值（X2）］作为自变量，以乳滴粒径及PDI 为评价指标（因变量Y），采用二因素五水平的CCD 响应面法优化处方。根据有效微乳区域确定因素的极大值和极小值，各因素水平代码值和实际操作量值见表2。按CCD响应面法原理安排13次试验，试验设计与结果见表3。采用Design-Expert 8.0软件，对表3试验结果进行非线性回归（二项式公式拟合），方差分析结果见表4和表5。

A.Km=1∶2 B.Km=2∶1 C.Km=3∶2 D.Km=3∶1 E.Km=2∶3图2 不同Km比例绘制的伪三元相图A.Km=1∶2 B.Km=2∶1 C.Km=3∶2 D.Km=3∶1 E.Km=2∶3Fig.2 Pseudo -ternary phase diagrams of different Km ratios

表2 因素与水平Tab.2 Factors and levels

表3 CCD响应面法试验设计与结果Tab.3 Design and results of CCD response surface method

表4 粒径回归方程方差分析结果Tab.4 Results of the analysis of the variance of the particle size regression equation

表5 PDI回归方程方差分析结果Tab.5 Results of Analysis of variance of the PDI regression equation

拟合方程：Y粒径= - 248.860 + 14.602X1-12.234X2+0.523X1X2-0.180X12-2.012X22

YPDI= -0.383+0.040X1-0.522X2+0.005X1X2-0.000 3X12+0.221X22

模型P值< 0.05 表示显著，失拟项P值> 0.05 表示不显著，即该模型在被研究的回归区域内拟合较好；若多元相关系数（R²）越大，则相关性越好；变异系数（CV）<10%，表示试验的可信度和精确度较高；精密度是有效信号与噪声的比值，>4视为合理［12］。由表6和表7可见，试验的拟合回归方程符合以上几个原则，适应性较好。根据拟合的方程，采用Design-Expert 8.0软件绘制油相质量分数与Km值对粒径和PDI 影响的等高线图及3D响应面图。详见图3。

表6 粒径回归方程误差分析结果Tab.6 Results of analysis of the error of the particle size regres⁃sion equation

表7 PDI回归方程误差分析结果Tab.7 Results of analysis of the error of the PDI regression equation

由图3 可知，固定Km值，随着油相的增加，粒径先增大后减小；当X1一定且不超过45%时，Km值的变化对粒径影响偏小，当X1一定且超过45%时，粒径随着Km值的增大而明显增大；固定Km值，随着油相的增加，PDI逐渐增大；当X1一定时，随着Km值的增大，PDI 先减小后增大。由Design Expert 8.0 软件分析优化出的最优结果为X1为34.39%、X2为0.88，即油相占34.39%、乳化剂占30.71%、助乳化剂占34.90%。预测出该最优处方的粒径理论值为44.34 nm，PDI为0.250。

2.5 验证试验

按最佳工艺条件进行3次验证试验，结果见表8，粒径分布见图4。得到的粒径平均值为44.22 nm，与理论预测值（44.34 nm）相差0.27%，PDI 平均值为0.251，与理论预测值（0.250）相差0.4%，表明该响应面模型有效，可靠性好。

图4 油相∶EL35∶PEG400为34.39∶30.71∶34.90时体系的粒度分布图Fig.4 Oil phase∶EL35：PEG400 was 34.39∶30.71∶34.90：A plot of the granularity distribution of the system

3 讨论

本研究中以辛夷油为油相、EL35为乳化剂、PEG400为助乳化剂，以油相质量分数X1和Km值（X2）为自变量，以微乳粒径及PDI 为评价指标，进行CCD 响应面试验设计，采用响应面法对制备工艺进行优化，得最佳处方，油相占34.39%，乳化剂占30.71%，助乳化剂占34.90%。预测出该最优处方的粒径理论值为44.34 nm，PDI 为0.250。经验证，实测值与预测值的偏差小于10%，响应面模型有效、可靠。

本研究中，Km值较大时，稀释过程中会出现黏度大的凝胶相，形成微乳的时间变长；Km值较小时，形成微乳的时间变短，且形成的微乳更加澄清；但Km<0.5时，混合体系形成微乳的点极少，难以绘制伪三元相图。Km值一定时，油相质量占比越大，形成微乳的时间逐渐变长，当油相质量占比超过一定范围，难以形成微乳。均匀设计与正交试验设计方法目前使用较多，采用线性模型进行拟合，呈试验次数较少，但精确度较低，预测性也较差。CCD 响应面法试验次数少，且试验精度高，预测性也较好，应用于药学研究的效果较好［14］。

a. 油相质量分数与Km值对粒径的影响b. 油相质量分数与Km值对PDI的影响图3 等高线图及3D响应面图a.Effect of oil phase mass fraction and Km value on particle sizeb.Effect of oil phase mass fraction and Km value on PDIFig.4 Contour map and 3D response surface map

当乳化剂与助乳化剂种类及质量比不同时，形成微乳的性质及特点均会产生较大差异，影响微乳粒径，也影响载药的质量和药效的发挥［15］。本研究中通过伪三元相图结合CCD 响应面法优化的辛夷油微乳处方客观、合理、稳定、可靠，且方法操作简便。