固相萃取-气相色谱-串联质谱法同时测定武汉市普通人群血清中35种有机氯农药与多氯联苯

李 想, 王丽梅, 宋璐璐, 万政策, 寇 婧, 张明烨, 吕永曼, 王友洁, 梅素容*

(1. 华中科技大学公共卫生学院环境医学研究所, 教育部环境与健康重点实验室, 湖北 武汉 430030; 2. 华中科技大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健系, 湖北 武汉 430030; 3. 华中科技大学同济医学院附属同济医院健康管理中心, 湖北 武汉 430030)

有机氯农药(organochlorine pesticides, OCPs)和多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是联合国环境规划署签署的“斯德哥尔摩公约”中两类主要的持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs),具有高毒性、持久性、生物蓄积性和远距离迁移性[1]。我国于20世纪70～80年代陆续禁产禁用OCPs和PCBs,但OCPs和PCBs仍可以在自然水体、土壤、食品及大气中广泛检出[2-5]。环境介质及食品中OCPs、PCBs的普遍污染导致人群的高暴露风险,对人类造成潜在的健康危害,如内分泌干扰效应、神经毒性、免疫毒性、生殖毒性和致癌效应等[6-9]。因此,人体内OCPs与PCBs暴露水平与健康风险的评估至关重要。

建立灵敏快速的人体内OCPs和PCBs的检测方法可为环境暴露与健康风险评估提供技术支持。高脂溶性的OCPs和PCBs易蓄积于人体的脂肪组织,但在实际研究中,脂肪组织不易获取[10]。在平衡状态下,血液中POPs的浓度可以代表蓄积在脂肪组织中的POPs浓度[11,12];且血液获取方便快捷,易获得不同年龄层的样本,因此血液被广泛用作评价OCPs、PCBs在人体内暴露水平的生物监测样本[13-15]。人体血液成分复杂,生物体内残留的OCPs、PCBs多处于痕量甚至超痕量水平,高效的前处理方法既可以实现对目标物的高效富集,又可以降低或去除基质的干扰[16]。相较于传统的液液萃取技术(liquid-liquid extraction, LLE),固相萃取技术(solid phase extraction, SPE)溶剂使用量少,样品富集与净化可以同时完成,使得检测灵敏度大幅提高[17]。OCPs和PCBs的仪器分析方法包括气相色谱-电子捕获检测法(GC-ECD)、气相色谱-质谱检测法(GC-MS)、气相色谱-串联质谱检测法(GC-MS/MS)等,其中GC-MS/MS可高效分离多种组分,特异性强、灵敏度高,适用于血液中痕量OCPs和PCBs的精准定量分析[18-20]。

目前,国内外已有许多人体内OCPs和PCBs残留的检测研究,屈伟月[21]建立的LLE串联硅胶柱-GC-MS/MS检测血清中12种OCPs和43种PCBs的分析方法回收率良好(79%～84%),检测组分多,但前处理操作复杂,样本用量大,且OCPs与PCBs不能同时检测;Stubleski等[22]建立的96孔板固相萃取-GC-MS/MS检测血中5种OCPs和16种PCBs的分析方法样本用量少,检出限在2.2～167.0 ng/L之间,但回收率不甚理想(31%～63%)。

基于此,本研究建立了一种快速简便、样本用量少、回收率和精密度良好的SPE-GC-MS/MS同时检测人血清中35种OCPs和PCBs的分析方法,并应用于武汉市普通人群体内OCPs和PCBs的浓度分布特征研究,为进一步开展人群健康效应研究提供技术支撑和基础数据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Trace 1300气相色谱-TSQ 8000三重四极杆质谱仪(美国Thermo Fisher公司);氮吹仪(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);固相萃取仪(美国Agilent公司);隔膜真空泵(美国GAST公司)。

Oasis®HLB固相萃取柱(1 mL/30 mg,美国Waters公司),胎牛血清(美国Thermo Fisher公司),尿素(分析纯,中国国药集团),二氯甲烷(农残级,美国J. T. Baker公司),甲醇(色谱纯,德国默克集团),正己烷(农残级,美国Sigma-Aldrich公司),纯净水(杭州娃哈哈集团)。

17种OCPs混合标准溶液(含α-六六六(α-HCH)、β-六六六(β-HCH)、γ-六六六(γ-HCH)、δ-六六六(δ-HCH)、p,p′-滴滴伊(p,p′-DDE)、p,p′-滴滴滴(p,p′-DDD)、p,p′-滴滴涕(p,p′-DDT)、艾氏剂(aldrin)、狄氏剂(diedrin)、异狄氏剂(endrin)、异狄氏剂醛(endrin aldehyde)、α-氯丹(α-chlordane)、γ-氯丹(γ-chlordane)、硫丹Ⅱ(endosulfan Ⅱ)、硫丹硫酸盐(endosulfan sulfate)、环氧七氯(heptachlor epoxide)、甲氧滴滴涕(methoxychlor))和18种PCBs混合标准溶液(含PCB-28、PCB-52、PCB-77、PCB-81、PCB-101、PCB-105、PCB-114、PCB-118、PCB-123、PCB-126、PCB-138、PCB-153、PCB-156、PCB-157、PCB-167、PCB-169、PCB-180、PCB-189)均购自美国AccuStandard公司。4种OCPs同位素内标13C6-γ-HCH、13C12-p,p′-DDE、13C12-p,p′-DDD、13C12-p,p′-DDT和18种13C12-PCBs同位素内标均购自美国CIL公司。

1.2 标准溶液的配制

混合标准贮备液:用正己烷稀释17种OCPs和18种PCBs混合标准溶液,配制成1 μg/mL的35种OCPs和PCBs混合标准贮备液,于-20 ℃保存。

标准工作溶液:准确量取一定量混合标准贮备液,用正己烷稀释,配制成50、20、10、5、2、1、0.50、0.20、0.10 ng/mL的系列标准溶液。

1.3 样品前处理

每份血清样本取100 μL,加入10 μL质量浓度为100 ng/mL的同位素内标溶液,涡旋混匀后置于4 ℃过夜;取出样本,用100 μL纯净水稀释,加入100 mg尿素,涡旋混匀,超声25 min;依次用3 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL纯净水活化平衡Oasis®HLB小柱;将样品全部过柱,并用1 mL纯净水润洗样品管两次,将液体全部导入HLB小柱,流速0.5～1 mL/min;用6 mL纯净水淋洗HLB小柱,真空抽干45 min;用5 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液(1∶1, v/v)洗脱,收集全部洗脱液。洗脱液氮吹近干,用正己烷定容至100 μL,进样测定。

1.4 分析条件

色谱条件:DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美国Agilent公司);以高纯氦气(99.999%)作为载气,柱流量1.0 mL/min,恒流模式;不分流进样模式,进样量1 μL;进样口温度250 ℃。色谱柱升温程序:初始温度60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至180 ℃,保持1 min,以3 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

质谱条件:三重四极杆质谱仪,配备电子轰击离子源,电离电压70 eV;离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃;定量分析采用多反应监测(MRM)模式,内标法定量。

1.5 血清样本采集

2018～2019年在武汉市同济医院体检中心采集武汉市普通人群血清样本共4 132份,依据采样时间(2018年秋季、2019年春季)、年龄(10个年龄组:≤30岁;31～35岁;36～40岁;41～45岁;46～50岁;51～55岁;56～60岁;61～65岁;66～70岁;>70岁)和性别将血清样本混合为40个样本池。本研究得到华中科技大学同济医学院伦理委员会批准,招募志愿者均签署知情同意书。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

按1.4节分析条件建立全扫描方法,根据化合物信息确定母离子后运行子离子扫描,选择丰度最高的两对离子对作为目标化合物的定量离子对和定性离子对,并确定每对离子对的最佳碰撞能量。优化后各目标物和内标的质谱分析参数见表1。

表 1 35种目标物与22种内标的质谱分析参数

2.2 方法学评价

2.2.1线性范围、方法检出限与定量限

按1.3节前处理流程处理空白胎牛血清之后,向其中加入不同浓度的混合标准溶液,配制质量浓度为0.01～50.0 ng/mL的基质匹配标准溶液,采用上述分析条件,以内标法进行定量分析,目标物标准曲线的线性范围、相关系数(r2)及方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)见表2。35种OCPs和PCBs在0.05～50.0 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数在0.989～0.999之间;以3倍信噪比相对应的浓度作为方法的检出限,以10倍信噪比确定方法的定量限,35种OCPs和PCBs的检出限在1.2～71.4 ng/L之间,定量限在4.1～238.1 ng/L之间。

2.2.2方法的准确度与精密度

采用胎牛血清进行加标回收率试验,分别向胎牛血清中添加不同浓度的混合标准溶液,每一组浓度做6个平行样,计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。在检测样本的同时检测空白胎牛血清和超纯水基质,监测仪器性能是否稳定并控制实验过程中可能存在的污染情况。35种OCPs和PCBs的加标回收率在72.6%～142%之间,RSD小于25%(见表3)。

表 3 35种分析物在胎牛血清中3个水平下的加标回收率和精密度(n=6)

2.3 方法学比较

血清样本珍贵,不易获取,其他文献报道的检测方法的样本使用量一般不少于500 μL[23-26],本研究检测血清用量只需要100 μL。Wittsiepe等[27]和Stubleski等[22]的方法样本使用量少,分别为200 μL和150 μL,但检测的OCPs组分少,加标回收率不甚理想(见表4),本研究检测组分多,检出限低,准确度与精密度高。同时,本方法操作简便,经过固相萃取就能有效去除杂质和富集痕量待测组分,简化了繁琐的前处理步骤,在大样本人群监测中能节约大量人力物力。

2.4 武汉市普通人群体内OCPs和PCBs的浓度分布特征研究

采用所建立的方法检测血清样本池中35种OCPs和PCBs浓度,从表5的结果发现:①武汉市普通人群血清中OCPs和PCBs的污染普遍存在,且以OCPs为主,其浓度水平依次为:p,p′-滴滴伊>β-六六六>γ-六六六>p,p′-滴滴涕>狄氏剂,其中p,p′-滴滴伊、p,p′-滴滴滴和甲氧滴滴涕检出率达100%; ②本研究武汉市普通人群中OCPs的浓度水平与北京市普通人群暴露水平一致,低于江苏普通人群OCPs暴露水平[28,29]。p,p′-滴滴伊/p,p′-滴滴涕比值通常作为p,p′-滴滴涕历史累积的指标,该比值小于10表明p,p′-滴滴伊主要来源于滴滴涕的近期暴露,比值大于10表明p,p′-滴滴伊来源于滴滴涕的历史暴露[30],本研究中p,p′-滴滴伊/p,p′-滴滴涕比值为58,推断武汉市普通人群血清中p,p′-滴滴伊的蓄积可能主要来自于滴滴涕的历史残留; ③从PCBs同系物组成来看,武汉市普通人群血清中主要以PCB-28、PCB-153和PCB-52为主,非类二噁英PCBs是主要成分,与国内其他人群体内PCBs的组成特征基本一致[31]。

2.5 血清中OCPs和PCBs浓度水平与年龄、性别的关系

血清中OCPs浓度随年龄增加呈升高趋势(见图1a), 66岁以上人群血清中OCPs浓度显著高于66岁以下人群(p<0.05),与我国莱州湾地区、吉林伊通等地人群血清样本池中OCPs浓度变化趋势一致,这可能是由于随着时间推移,经由各种途径暴露的OCPs在人体中出现累积效应,提示年龄是影响人体OCPs负荷水平的重要因素[32,33]。46～55岁以及61～65岁人群血清中PCBs浓度水平略高于其他年龄组,但无显著性差异(见图1b),与Meng等[34]的研究结果一致,这可能是因为虽然我国从20世纪80年代开始禁止生产使用PCBs,但工业焚烧和废旧电器的泄漏使得我国居民处于PCBs的持续暴露中[35,36]。

表 5 血清样本中OCPs和PCBs的质量浓度(n=40)

图 1 不同年龄、性别血清样本池中OCPs和PCBs的浓度分布(n=40)Fig. 1 Concentration distributions of OCPs and PCBs in pooled serum by age and gender (n=40)

60岁以下女性血清中OCPs浓度水平和相同年龄段男性血清中OCPs浓度水平无显著性差异,而60岁以上女性血清中OCPs浓度水平较高,是相同年龄段男性血清中OCPs浓度的2～3倍(p<0.05,见图1a),与Thomas等[37]、Porta等[38]的研究结果基本一致,这可能与男女饮食习惯的差异有关。与男性相比,女性偏向于摄入更多的蔬菜水果,而蔬菜水果中往往含有较高的OCPs残留[39]。男性和女性血清中PCBs浓度水平无统计学差异(见图1b),与Zheng等[40]、Du等[41]的研究结果一致。不同季节(2018年秋季、2019年春季)收集的血清样本池OCPs和PCBs浓度水平也无统计学差异,可能是因为春秋两季人群膳食模式和食物来源无明显变化。

3 结论

本研究建立了固相萃取-气相色谱-串联质谱联用技术同时检测人血清中35种OCPs和PCBs的方法,该方法检出限低、回收率及精密度良好,且样本用量少,操作简便,检测组分多,适用于环境健康研究中大样本人群的生物监测,为OCPs和PCBs的人体内暴露水平与健康风险评估提供技术支持。利用建立的方法检测了武汉市普通人群血清样本中OCPs和PCBs的浓度水平,武汉市普通人群广泛暴露于OCPs和PCBs,且以OCPs为主,非类二噁英PCBs是PCBs的主要成分。血清中OCPs浓度随年龄增长呈升高趋势,OCPs浓度在60岁以上存在性别差异,不同性别血清中PCBs浓度无统计学差异。