水稻秸秆生物质炭对Shewanella oneidensis MR-1异化铁还原过程的抑制作用及其潜在机制分析

钱永明，任东，唐凤琳，杨浈，吴云当，路璐，彭超1，*

（1.西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637009；2.西华师范大学环境科学与工程学院，四川 南充 637009；3.西华师范大学化学合成与污染控制四川省重点实验室，四川 南充 637009；4.北京大学城市与环境学院，北京 100871；5.广东省科学院生态环境与土壤研究所/广东省农业环境综合治理重点实验室，广州 510650）

铁（Fe）是环境中具有高活性和高丰度的元素，同时也是构成生命体的必需重要元素之一。由Fe（Ⅱ）与Fe（Ⅲ）的氧化和还原过程组成的铁循环，关联着环境中多个元素和污染物的生物地球化学过程。在pH中性的环境中，Fe（Ⅲ）多以固体铁矿物的形式存在。大量研究表明，这些铁矿物的表面具有较强的化学活性，在环境中能作为吸附剂影响污染物的迁移，或作为催化剂促进环境中多种物质的转化过程。

在环境中铁还原过程由生物和非生物的化学反应共同驱动。异化铁还原微生物（铁还原微生物）是一种能够在无氧的条件下，利用有机质、氢气等多种物质为电子供体，将Fe（Ⅲ）还原为Fe（Ⅱ）的微生物。铁还原微生物在环境中广泛分布，其对Fe（Ⅲ）矿物的还原影响着环境中众多的生物和化学过程，具有重要的环境意义。然而，由于处于固态的铁矿物难以穿过细胞膜，如何将电子从细胞转移给铁矿物是微生物铁还原过程的主要限制因素之一。除了微生物自身建立的一套胞外电子传递系统以外，在环境中还存在一些氧化还原活性物质，能够作为电子穿梭体在微生物与铁矿物之间传递电子，让铁还原微生物在不与铁矿物发生直接接触的情况下还原Fe（Ⅲ）。最近的研究发现，作为环境功能材料之一的生物质炭能够影响微生物铁还原过程。但目前关于生物质炭对微生物铁还原过程的影响仍存在争议。由于菌种、生物质炭类型、实验浓度设置等的差异，甚至出现了相悖的结论。一部分研究发现，生物质炭能够促进微生物铁还原，然而又有一些研究发现同样的生物质炭在一定生物质炭和铁的浓度比例下会抑制微生物铁还原。目前已知的生物质炭影响微生物铁还原过程的机制有多种，包括通过生物质炭表面的化学官能团在细胞和矿物之间传递电子、在生物质炭的双电层（Electrical double-layer）存储或释放电子、利用生物质炭的导电性直接在细胞和矿物之间传递电子，以及对细胞进行吸附形成团聚体改变细胞与矿物的接触关系等。

在过去对生物质炭介导微生物铁还原的多数研究中，使用的水铁矿浓度都相对较高，有一些甚至达到每升数十毫摩尔（mmol·L）。然而在实际环境中，生物质炭和铁的添加量和天然含量都在较大的范围内波动，在不同环境中的差异甚至可达到2~3个数量级，同时环境中水铁矿含量大多也仅占总铁浓度的一小部分，且在不同环境中含量不同。此外，研究表明，微生物铁还原的速率与水铁矿浓度呈正比，而由于一些在中高温度条件下制备的生物质炭具有较高的得失电子能力，能够快速对铁矿物进行化学还原，降低初始铁浓度。因此，铁矿物的浓度很可能是影响生物质炭介导微生物铁还原的关键因素之一。为了验证该推测，进一步明晰生物质炭影响微生物铁还原的机制，本实验制备水稻秸秆生物质炭，借助介导电化学技术明确其得失电子能力；在多个不同水铁矿浓度条件下，开展铁还原菌MR-1 细胞悬浮培养实验，在多个生物质炭和水铁矿浓度条件下测定了微生物铁还原的反应速率；借助化学成分分析和共聚焦显微镜成像等技术手段，分析MR-1 在不同生物质炭和水铁矿浓度下还原水铁矿的动力学，观察微生物细胞与生物质炭形成的聚合体的形态。该研究对揭示具有不同铁浓度的环境中生物质炭介导微生物铁还原的机制有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 生物质炭的和铁矿物的制备

采集水稻收获后的新鲜秸秆，用自来水初步清洗后，避光风干。磨碎过10 目筛，置于有盖坩埚内放在马弗炉中，在500 ℃下无氧热解2 h（持续通N，流量200 mL·min）。自然冷却到室温后，再次过10目筛，用0.1 mol·LHF-HCl浸洗24 h，重复两遍，再用去离子水清洗生物质炭到无F、Cl检出，以排除生物质炭中残余的矿物成分对微生物铁还原过程中电子传递过程的干扰。最后避光风干，磨碎过230 目筛后避光保存。

水铁矿（Fh）和针铁矿（Gt）使用九水合硝酸铁和氢氧化钾在实验室合成，矿物的具体合成方案参考AMSTAETTER 等的方法。在无氧手套箱中（100%N，布劳恩Unilab Pro）利用无氧水将铁矿物配制成悬浮液，存储于血清瓶中，用丁基胶塞密封试管口，加盖铝盖，避光保存。

1.2 菌株及微生物铁还原实验

MR-1，最初分离自美国Oneida 湖的无氧沉积物中，是目前研究较为广泛的铁还原微生物之一。

将MR-1 菌株于-80 ℃冷冻保存，在实验前通过划线接种至含有LB 固体培养基的平板上（培养基成分：胰蛋白酶10 g·L、酵母提取物5 g·L、NaCl 10 g·L、琼脂 15 g·L），于 28 ℃恒温静置培养约 24 h 后，保存于4 ℃冰箱中。在LB 固体培养基上挑取MR-1的单一菌落，接种到LB液体培养基中进行避光培养，摇床速度为150 r·min，培养温度为28 ℃。通过OD值检测培养过程中微生物的生长曲线，培养约12 h后，离心（5 000，5 min）收集处于对数期后期的细胞（OD约 0.41），离心之后倒掉上清液，用无氧的PIPES 缓冲溶液（10 mmol·L，pH 为 7）重新悬浮细胞，并再次进行离心（5 000，5 min）。重复操作两次，以去除残余的LB 培养基。最后用无氧的PIPES缓冲溶液重新悬浮细胞，制备成约20 倍浓缩的细胞悬浮液。

在pH=7的PIPES无氧培养液（10 mmol·LPIPES）中按照顺序分别添加不同浓度的水铁矿（2、4、10 mmol·L）或针铁矿（4 mmol·L）、10 mmol·L乳酸钠、不同浓度生物质炭（2、4、10 g·L），取一定量的浓缩的细胞悬浮液添加到PIPES 无氧培养液中，使其最终细胞数为6.20×10个·µL，最后分装到亨盖特厌氧培养管（顶空含100%N）中，用丁基胶塞密封试管口，加盖铝盖，在28 ℃无氧黑暗的条件下静置培养。每个实验设置3 个重复，同时设置不加生物质炭的对照组和未添加细胞的非生物对照组。

1.3 Fe（Ⅱ）浓度测定和微生物铁还原速率计算

培养过程中每隔数小时采集样品，通过斐林试剂法测得样品中Fe（Ⅱ）浓度。具体步骤为：首先，用N清洗过的注射器采集样品，然后迅速用1 mol·L盐酸（水铁矿处理）或6 mol·L盐酸（针铁矿处理）对样品进行稀释，于室温（水铁矿处理）或60 ℃培养箱（针铁矿处理）中避光静置2 h 后离心（5 000，1 min）取上清液。在 96 孔板中，用 1 mol·L盐酸溶液对样品再次进行再次稀释，然后混合斐林试剂溶液（0.1%∶ferrozine，50%∶醋酸铵）培养5 min后，利用微孔板酶标仪（Multiskan GO，Thermo Fisher Sci⁃entific 公司）测量波长为562 nm 处的吸光值，与使用（NH）Fe（SO）·6HO 和 1 mol·L盐 酸 制 得 的 Fe（Ⅱ）标准曲线进行比较，测得Fe（Ⅱ）浓度。最后利用Excel 软件选取铁还原最快的时期中至少3 个时间点的Fe（Ⅱ）浓度变化，进行一元线性回归分析[=a+b，式中：为时间，为Fe（Ⅱ）浓度]，从线性拟合直线的斜率得出微生物铁还原的速率。

1.4 介导电化学分析

采用介导电化学氧化（MEO）和还原（MER）方法对生物质炭的供电子能力（）和得电子能力（）进行定量化测定。测试系统由电化学工作站（CHI 760E）和介导测试反应装置两部分组成，其中三电极测试体系由石墨板（工作电极）、铂网（对电极）和Ag/AgCl 电极（参比电极）组成，介导剂分别为ABTS 和Ziv，测试电压分别为 0.61 V 和−0.49 V，电介质溶液为 0.1 mol·LKCl（pH=7.0，PBS）。为排除氧气对测试体系的干扰，测试前所有溶液均采用高纯氮气脱氧处理20 min。于i-测试模式下达到稳定电流，加入 500 µL 10 mmol·L的 ABTS 或 ZiV 溶液，待反应电流回到基线并再次稳定后，向测试体系加入100 µL 生物质炭悬浮液（1.0 g·L），得到生物质炭得失电子过程中的i-曲线。最后，采用公式（1）和公式（2）对生物质炭的和进行计算。

式中：和分别为介导还原和氧化电流，A；F 为法拉第常数，96 485 C·mol；为加入测试体系中生物质炭的质量，g；为积分时间，s。

1.5 激光扫描共聚焦显微镜观察

细胞悬浮液的制备同1.2。首先用4%甲醛溶液对细胞进行固定，然后利用含有SYTO 9 和Propidium iodide 的死活菌染色试剂盒（Live/Dead BacLight，Invi⁃trogen）对菌体进行避光染色。染色完成后，将细胞添加到含有 10 g·L生物质炭和 4 mmol·L水铁矿的PIPES 缓冲溶液中，并使最终细胞浓度达到与实验中相同的6.20×10cells·µL。利用Leica TCS SP8 激光扫描共聚焦显微镜系统获取样品中生物质炭、铁矿物和细胞沿Z 轴方向的系列图层，使用的激发光波长为488 nm。然后使用NIH ImageJ 1.53 软件对采集到的系列图层进行最大密度投影（Maximum intensity pro⁃jection）处理，分析生物质炭、铁矿物和细胞的结合和空间分布情况。

1.6 统计分析

采用SPSS 25.0 对不同实验设置条件下测得的微生物铁还原速率、生物质炭的得电子能力（）和失电子能力（）的结果进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），<0.05 时认为具有显著性差异的统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同生物质炭浓度对微生物异化铁还原的影响

在加入生物质炭的处理中，在0时刻有大量Fe（Ⅱ）产生，其浓度随着生物质炭浓度的增加而增加（图1）。平均每克生物质炭与水铁矿[4 mmol·LFe（Ⅲ）]反应生成了约174.8µmol Fe（Ⅱ）。在之后的培养时间里，在添加了生物质炭的处理中，微生物铁还原的速率和程度均明显低于不添加生物质炭的对照组。在对照组中，微生物铁还原的速率为110.1 µmol·L·h，而在添加了 2、4、10 g·L生物质炭的实验组中，微生物铁还原的速率分别为 36.9、34.5、65.8 µmol·L·h，其中添加了2、4 g·L生物质炭的样品与不添加生物质炭或添加10 g·L生物质炭的样品的微生物铁还原的速率具有显著差异。

图1 不同生物质炭浓度条件下微生物对水铁矿的还原Figure 1 Reduction of ferrihydrite by MR-1 at different biochar concentrations

2.2 不同铁矿物浓度对生物质炭介导微生物铁还原的影响

为了研究铁矿物的浓度对生物质炭介导微生物异化铁还原动力学的影响，在添加及不添加10 g·L的生物质炭条件下，实验设置了2、4、10 mmol·L3个Fe（Ⅲ）浓度。此外，还设置了一个加入针铁矿的对照，以验证在0时刻生成的Fe（Ⅱ）是否为水铁矿与生物质炭的反应生成，排除盐酸对亚铁进行提取的过程对结果的干扰。结果发现，铁矿物的浓度会显著影响微生物还原水铁矿的动力学，在添加了生物质炭的处理中，铁矿物浓度的变化对微生物铁还原过程的影响更为显著。如图2 所示，微生物铁还原速率和程度随着Fe（Ⅲ）浓度增加而增加。在添加了生物质炭的处理中（图2A），Fe（Ⅲ）浓度为2 mmol·L时微生物铁还原几乎被完全抑制，其铁还原速率仅有17.8µmol·L·h。而随着 Fe（Ⅲ）浓度升高，在含有生物质炭的处理中，当Fe（Ⅲ）浓度为4、10 mmol·L时的铁还原速率分别为 83.4 µmol·L·h和 105.1 µmol·L·h，分别是Fe（Ⅲ）浓度为2 mmol·L时的4.69倍和5.90倍。在不含生物质炭的处理中（图2B），当Fe（Ⅲ）浓度从 2 mmol·L增加到 4 mmol·L和 10 mmol·L后，微生物的铁还原速率从 53.4 µmol·L·h分别增加到133.3 µmol·L·h和251.2 µmol·L·h，分别是Fe（Ⅲ）浓度为 2 mmol·L时的 2.50 倍和 4.70 倍。在使用针铁矿为铁源的处理中，添加生物质炭后，在0时刻和实验的培养时间内（约23.4 h）均未检测到Fe（Ⅱ）的产生（图2A），证明添加针铁矿和生物质炭的处理中，0 时刻所产生的Fe（Ⅱ）不是在用HCl 对铁进行提取的过程中生物质炭对Fe（Ⅲ）的还原所产生的。

图2 不同Fe（Ⅲ）浓度和矿物种类条件下的微生物铁还原Figure 2 Microbial iron reduction at different concentrations of ferrihydrite and goethite

2.3 生物质炭的氧化还原特性和对微生物细胞的吸附

电化学分析的结果发现，该生物质炭的给电子能力为（0.29±0.06）mmol·g，得电子能力为（0.91±0.21）mmol·g（图3），其得电子能力是给电子能力的3.14倍，二者具有显著差异（<0.05）。其给电子能力高于实验中测得的对4 mmol·L水铁矿的还原能力（约0.17 mmol·g）（图 3）。

图3 生物质炭的得电子能力（EAC）和失电子能力（EDC）Figure 3 Electron accepting capacities（EAC），and electron donating capacities（EDC）of biochar

共聚焦激光显微镜成像发现，在混合了4 mmol·L水铁矿、6.20×10cells·µLMR-1 细胞和 10 g·L生物质炭的处理中，有大量的细胞吸附在生物质炭表面，形成聚合体，但聚合体中并没有明显观察到水铁矿，许多细胞仍自由悬浮于液体中（图4）。

3 讨论

本研究发现在不同的生物质炭和铁浓度条件下，生物质炭均抑制了微生物的铁还原过程，这与以往的许多研究中发现的生物质炭促进微生物铁还原的现象相反。同时，本研究还发现了生物质炭可以化学还原水铁矿，从而降低初始Fe（Ⅲ）浓度的现象，以及生物质炭吸附细胞于其表面、形成微生物细胞和生物质炭的聚合体的现象。

生物质炭对微生物铁还原过程的抑制作用可能与其自身对水铁矿的还原所导致的初始Fe（Ⅲ）浓度下降有关。在本研究中，无论是否添加生物质炭，微生物铁还原的速率与水铁矿浓度呈正比（图2），即当水铁矿的浓度升高时，铁还原速率也随之升高，这与前人的研究结果类似。因此，生物质炭自身对水铁矿的还原所导致Fe（Ⅲ）浓度的降低（图1），可能是其在低铁浓度条件下抑制微生物铁还原的原因之一。此外，本研究还发现，相比不添加生物质炭的对照组，在添加生物质炭（10 g·L）的处理中，铁矿物浓度的变化对微生物铁还原速率的影响更为显著。当铁浓度从2 mmol·L增加到4 mmol·L时，在添加生物质炭（10 g·L）的处理中微生物铁还原速率增加了3.69 倍（图2A），而在不添加生物质炭的处理中仅增加了1.50 倍（图2B）。这可能是由于随着初始Fe（Ⅲ）浓度的升高，相同浓度生物质炭化学还原水铁矿，降低一部分初始Fe（Ⅲ），因此对微生物铁还原速率的负面影响相对降低。该结果证明水铁矿的浓度在生物质炭介导微生物铁还原过程中扮演了重要的作用。

生物质炭抑制微生物铁还原的另一个原因可能与细胞-生物质炭聚合体的形成有关。共聚焦激光显微镜结果发现一部分细胞吸附于生物质炭的表面形成聚合体，且在聚合体中并没有发现水铁矿（图4）。这一现象与前人发现当铁矿物与微生物细胞-生物质炭聚合体结合时生物质炭才会促进微生物铁还原的现象一致。这种由微生物和生物质炭形成的聚合体，可能会限制微生物和生物质炭在溶液中的活动性，减少微生物和生物质炭与水铁矿的接触概率，进而抑制电子传递给水铁矿。然而，由于在过去类似的研究中，使用的水铁矿的浓度都相对较高，如15 mmol·L和 30 mmol·L等，远高于本研究中所使用的4 mmol·L。在含有较高浓度水铁矿的情况下，即使也有微生物-生物质炭聚合体的形成和一部分Fe（Ⅲ）被还原的现象，但由于其体系中依然有足够高浓度的水铁矿供微生物接触和还原，因此对后期培养过程中微生物铁还原的抑制作用并不显著。本研究中的结果也支撑了这一推论，当水铁矿的初始浓度相对较低时，生物质炭对微生物铁还原的抑制作用更为显著（图2）。

图4 激光扫描共聚焦显微镜拍摄到的生物质炭颗粒和微生物细胞沿垂直方向的堆叠图Figure 4 Biochar particles and bacterial cells photographed using laser scanning confocal microscopy

同时，由于本研究中使用的生物质炭具有较高的给电子和得电子能力（图3），在形成不含水铁矿的微生物-生物质炭聚合体后，生物质炭可能取代水铁矿作为微生物呼吸作用的电子受体，与水铁矿产生竞争关系，这可能是本研究中生物质炭进一步抑制微生物对水铁矿的还原另一个原因。

此外，该研究结果与以往研究结果不同，也可能与使用了不同的物理化学特性的生物质炭有关。本研究中使用的是去除了煅烧过程中产生的矿物质成分的生物质炭，而前人对该过程的研究中多使用包含矿物成分的生物质炭。已有的研究发现，生物质炭中的矿物成分可能会影响生物质炭对有机质的吸附，而这些矿物成分对生物质炭介导微生物铁还原过程的影响目前仍然未知，值得在未来开展进一步深入的研究。同时，在本实验中，不同生物质炭（2~10 g·L）和水铁矿浓度（2~10 mmol·L）下，生物质炭均对微生物铁还原有抑制作用。YANG 等在研究木材煅烧的生物质炭介导微生物铁还原的研究中发现，生物质炭与Fe（Ⅲ）的质量浓度比（g·mmol）高于或低于一个固定比值时，生物质炭对微生物铁还原分别表现出促进和抑制作用的现象。有研究发现浓度为10 mg·L的石墨烯就会对微生物铁还原过程表现出抑制作用。因此，氧化还原活性和吸附能力不同的生物质炭或碳基材料在不同的环境条件下对微生物铁还原过程的影响可能不尽相同，并非所有的生物质炭都能够促进微生物铁还原。

目前，生物质炭作为新型碳材料在农业环境领域中得到了广泛的应用，本研究的结果为生物质炭的环境效应提供了基础数据。本研究发现在生物质炭介导微生物铁还原过程中，生物质炭不仅作为电子穿梭体促进微生物铁还原，也可以通过其自身的氧化还原特性改变环境中水铁矿的浓度，以及通过吸附细胞形成聚合体等方式参与微生物铁还原的过程。生物质炭对微生物铁还原过程的抑制，可能会进而影响到环境中与铁还原微生物厌氧呼吸相关的多种电子供体的降解过程，例如微生物对有机质的降解、甲烷的氧化，以及最新发现的铵根离子的降解等。同时，由于环境中的铁是由多种不同的类型的各类铁矿物混合而成的，在一些环境中，具有较高生物利用度的水铁矿浓度可能相对较低。许多生物质炭均有一定的给电子能力，进而能够还原Fe（Ⅲ），在以往的研究中发现生物质炭的给电子能力可以达到2 mmol·g。在一些具有较低浓度水铁矿的环境中，施加具有较强化学铁还原和与铁还原微生物形成聚合体能力的生物质炭，可能会强烈抑制环境微生物铁还原过程。在未来需进一步从微生物-生物质炭聚合体和生物质炭-铁矿物的反应效应等方向对生物质炭介导微生物铁还原过程的机制展开深入研究。

4 结论

（1）该研究中的水稻秸秆生物质炭显著抑制了微生物铁还原过程。

（2）生物质炭对微生物铁还原过程的抑制作用可能有两个原因：一是生物质炭对水铁矿的化学还原降低了初始Fe（Ⅲ）浓度；二是形成了微生物-生物质炭聚合体。

（3）水铁矿初始浓度相对较低时，生物质炭对微生物铁还原的抑制更显著。

（4）铁矿物浓度是影响生物质炭介导微生物铁还原过程的重要因素。

感谢西华师范大学侯怡铃教授和白鑫同学提供实验平台，以完成本项目中激光扫描共聚焦显微镜实验。