韭菜叶绿素铜、锌钠盐的制备及稳定性研究

洪军，李倩，张开放，薛佳琳，蒋梦瑶，刘志宏，马栋豪

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467041；2.河南久星生物科技研究院有限公司，河南 平顶山 467036)

天然绿色素的主要成分是叶绿素，大多来自植物提取物，是一种双羧酸酯，不溶于水，可溶于有机溶剂，具有生理活性同时兼有营养、保健等功能，因此被较早地开发应用[1-2]。天然绿色素也是一种实用色素，存在提纯困难、稳定性差等缺点，实用天然色素的安全性也受植物生长过程中农药、土地、水源、空气等多方面的影响[3]。由于天然色素不太稳定，在其使用过程中容易受各种因素如光照、温度、氧化还原剂、pH值、金属离子、添加剂等[4-5]影响而发生褪色、变色，影响其着色效果，严重制约了天然色素替代人工合成色素的进程。有研究表明，将天然色素制备成叶绿素铜钠盐或锌钠盐，有利于天然色素稳定性的保持[6-7]。叶绿素铜、锌钠盐是叶绿素的衍生物，也是一种可食用的绿色色素且能增强叶绿素的稳定性。随着人们对天然色素需求的不断增加，对其稳定性及功能研究也日渐增多[8-13]。

韭菜又名“起阳草”,是一种绿色蔬菜，含有丰富的叶绿素、多种活性物质如含硫化合物、黄酮类化合物、甾体皂苷类化合物、含氮化合物、植物油类、维生素、微量元素等，经常食之具有诸多好处，如降低胆固醇及血脂、清热解毒及对心血管疾病有一定的预防和治疗作用等[14-15]。但是，关于韭菜叶绿素及其衍生物稳定性的相关研究尚未见报道。因此，本研究以新鲜韭菜为原材料提取叶绿素，通过将其制成铜、锌钠盐对其稳定性进行研究，为同种类的天然叶绿素衍生物稳定性的研究提供了理论支持，又可提高韭菜的经济附加值，为其深加工探索新途径[16]。

1 材料与方法

1.1 材料与器材

材料：韭菜、皂基、食盐、蔗糖、淀粉、椰子油、棕榈油、橄榄油、面粉等。

试剂：蒸馏水、95%食用乙醇、氢氧化钠、石油醚、盐酸、硫酸锌溶液、硫酸铜溶液、30% H2O2、无水亚硫酸钠等。

器材：玻璃棒、烧杯、量筒、分液漏斗、胶头滴管、pH计、GFL-125型烘箱、粉碎机、RE-52A型旋转蒸发仪、HWS12型恒温水浴锅、电子天平、KQ5200DE型超声波清洗仪、Genesys 10S型紫外分光光度计、酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 叶绿素铜、锌钠盐的制备

将新鲜韭菜叶洗净、切段、烘干、粉碎、过筛，按液料比20∶1(mL/g)的比例向韭菜粉中加入95%食用乙醇，在60 ℃、200 W条件下超声提取60 min，抽滤，滤液于旋转蒸发仪中浓缩至1 g/mL，加入10% NaOH调节pH至12～13，然后在60 ℃下超声皂化30 min，冷却，加入皂化液等体积的石油醚，充分振荡，静置分层，上层醚液呈黄色即为完全皂化。用10% HCl将皂化液pH值调至1.5～2.0，加入10%硫酸铜(硫酸锌)溶液，铜(锌)离子的加入量按叶绿素分子中所含的镁离子理论量的1.5～2.0倍加入，60 ℃下水浴2 h，抽滤，洗涤后将所得沉淀溶于乙醇中，加入10% NaOH溶液，调溶液pH值至12～13，静置，烘干得到叶绿素铜(锌)钠盐。

1.2.2 叶绿素铜、锌钠盐的光谱图

分别取叶绿素铜、锌钠盐0.1 g，用蒸馏水溶解，定容至100 mL，二者分别取1 mL和2 mL的叶绿素铜钠盐溶液加蒸馏水定容至10 mL，以蒸馏水做空白参照，用紫外分光光度计在350～700 nm波长内扫描。

1.2.3 叶绿素铜、锌钠盐的稳定性研究

分别称取0.1 g叶绿素铜、锌钠盐，用蒸馏水溶解并定容至1 L，制得0.01%的叶绿素铜、锌钠盐水溶液为备用液1；分别称取0.1 g叶绿素铜、锌钠盐，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，制得0.1%的叶绿素铜、锌钠盐水溶液为备用液2。

1.2.3.1 光照对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

每份取10 mL备用液1中的叶绿素铜、锌钠盐水溶液密封于试管中，放置在室内自然光照下，分别放置0，1，2，3，4，5，6，7，8 d。在每天的同一时间取少量溶液用酶标仪测量溶液的吸光度，重复3次。

1.2.3.2 温度对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

每份取10 mL备用液1中的叶绿素铜、锌钠盐水溶液密封于试管中，分别于40，60，80，100 ℃的水浴锅中水浴20 min。用酶标仪测量吸光度，重复3次。

1.2.3.3 酸、碱性对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

每份取10 mL备用液1中的叶绿素铜、锌钠盐水溶液密封于试管中，用10%的NaOH和HCl溶液调酸碱性，配成pH值接近2，4，6，8，10，12的溶液。测量相应pH条件下叶绿素铜、锌钠盐溶液的吸光度，重复3次。

1.2.3.4 氧化还原剂对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

每份取1 mL备用液2中的叶绿素铜、锌钠盐水溶液密封于试管中，分别加入0%、0.30%、0.60%、0.90%的H2O2和Na2SO3溶液9 mL进行10倍的稀释。测量溶液的吸光度，重复3次。

1.2.3.5 食品添加剂对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

每份取1 mL备用液2中的叶绿素铜、锌钠盐水溶液密封于试管中，分别加入0%、2%、4%、6%的食盐，蔗糖和淀粉溶液9 mL进行10倍的稀释。测量溶液的吸光度，重复3次。

1.2.4 叶绿素铜钠盐的应用

1.2.4.1 手工皂

取100 g皂基于烧杯中，将其在微波炉中溶解后加入橄榄油、椰子油及棕榈油各1 mL，混合均匀后加入1 mL叶绿素铜钠盐溶液，搅拌均匀后迅速倒入模具中，注意避免表面产生气泡，过夜，脱模。

1.2.4.2 面条

取适量面粉备用，将所制叶绿素铜钠盐溶于适量水中调至溶液颜色鲜艳漂亮，用其与面粉混合均匀制成色素面团，最后将面团擀成饼状在压面机中压成色素面条。

2 结果与分析

2.1 叶绿素铜、锌钠盐的特征光谱

由图1可知，在350～700 nm范围内叶绿素铜钠盐在408 nm和634 nm波长下有峰值，由于在408 nm波长下吸收峰最大，所以在408 nm波长下分别测定光照、温度、pH、氧化还原剂和食品添加剂对叶绿素铜钠盐稳定性的影响。

图1 叶绿素铜钠盐吸收光谱Fig.1 The absorption spectra of sodium copper chlorophyll

由图2可知，在350～700 nm范围内叶绿素锌钠盐在412 nm和632 nm波长下有峰值，由于其在412 nm波长下吸收峰最大，所以在412 nm波长下分别测定光照、温度、pH、氧化还原剂和食品添加剂对叶绿素锌钠盐稳定性的影响。

图2 叶绿素锌钠盐吸收光谱Fig.2 The absorption spectra of sodium zinc chlorophyll

2.2 叶绿素铜、锌钠盐的稳定性研究

2.2.1 光照对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

由图3可知，随着光照时间的延长，叶绿素铜、锌钠盐的OD值均不断降低，锌钠盐的OD值降低更多，并且在3 d之后二者颜色与其开始相比均从视觉上可以看出明显褪色，同样是锌钠盐褪色更多，说明光照对叶绿素铜、锌钠盐的稳定性影响大，应避光保存，相同光照条件下叶绿素铜钠盐的稳定性更好。

图3 叶绿素铜、锌钠盐在不同光照时间下的吸光值Fig.3 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll under different illumination time

2.2.2 温度对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

由图4可知，随着温度的逐渐增加，叶绿素铜、锌钠盐的吸光值均变化不明显，整体铜钠盐的吸光值变化更小，因此得出在0～100 ℃温度范围内，温度对叶绿素铜、锌钠盐的稳定性均影响较小，二者均耐热性较好，相同温度条件下叶绿素铜钠盐的稳定性更好。

图4 叶绿素铜、锌钠盐在不同温度下的吸光值Fig.4 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll at different temperatures

2.2.3 酸、碱性对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

由图5可知，叶绿素铜、锌钠盐均在中性和碱性条件下吸光度较高，在酸性条件下吸光度低且有沉淀生成，其中锌钠盐在酸性条件下吸光值更低，pH大于8时OD值下降明显，整体铜钠盐的吸光值更高，说明叶绿素铜、锌钠盐在保存时均应避免强酸性条件，可在中碱性条件下进行保存，相同pH条件下叶绿素铜钠盐更稳定。

图5 叶绿素铜、锌钠盐在不同pH下的吸光值Fig.5 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll at different pH values

2.2.4 氧化还原剂对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

由图6可知，在叶绿素铜钠盐溶液中加入同种浓度的氧化还原剂时，加入氧化剂的叶绿素铜钠盐的OD值降低更多，说明氧化剂对叶绿素铜钠盐的影响大于还原剂，且高浓度下对其影响较大。因此，对于叶绿素铜钠盐的保存和应用应避免高浓度氧化剂，而氧化还原剂对叶绿素锌钠盐的稳定性影响较小。

图6 叶绿素铜、锌钠盐在不同浓度氧化还原剂下的吸光值Fig.6 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll at different concentration of oxidants and reductants

2.2.5 食品添加剂对叶绿素铜、锌钠盐稳定性的影响

由图7可知，对于常见食品添加剂加入到叶绿素铜、锌钠盐时其OD值相较于对照组变化不大，说明常见食品添加剂对叶绿素铜、锌钠盐的稳定性影响较小。

图7 叶绿素铜、锌钠盐在不同食品添加剂下的吸光值Fig.7 The absorption values of sodium copper chlorophyll and sodium zinc chlorophyll with different food additives

2.3 叶绿素铜钠盐的应用效果

将叶绿素铜钠盐应用在面条上，从颜色上来看，随着光照处理延长，面条有褪色现象，但仍可以看出绿色，说明叶绿素铜钠盐提高了天然叶绿素的稳定性，增强了其耐光性。

将叶绿素铜钠盐应用在手工皂上，与避光保存的手工皂相比，经过光照处理3 d后的手工皂有稍许褪色，但整体颜色差异不明显。

3 讨论

叶绿素中含有天然活性物质，可以预防多种疾病，将其制成叶绿素铜、锌钠盐很好地提高了其稳定性且将其由脂溶性物质转变为了水溶性物质，从而极大地扩大了其应用范围。实验提取的叶绿素铜、锌钠盐均带有金属光泽，易溶于水，为墨绿色，着色性好，耐热性好，在中碱性条件下稳定性较好，常见的食品添加剂对二者稳定性的影响不大，且氧化还原剂对叶绿素锌钠盐的影响较小，这与赖海涛等[17]对紫菜叶绿素铜钠盐的制备及其稳定性研究的结果相似。虽然叶绿素铜、锌钠盐的稳定性相对于叶绿素来说大大增强，但强酸及光照条件对二者的稳定性还是有一定影响，因此在保存和应用叶绿素铜、锌钠盐时应避免光照及强酸性条件。另外，高浓度氧化剂对叶绿素铜钠盐也有一定影响，这与李祥等[18]对剑麻膏中叶绿素铜钠盐稳定性研究的结果相似，因此在保存叶绿素铜钠盐时还应避免高浓度氧化剂，以便保持更好的应用效果，实验整体可以得出叶绿素铜钠盐的稳定性更好。目前，叶绿素铜钠盐是我国唯一允许在食品工业使用的绿色色素，被广泛应用于食品和日用品甚至医药等方面[19],在食品中可应用于各种糖果、糕点等中，实验中将叶绿素铜钠盐应用在手工面条及手工皂也反映出叶绿素铜钠盐具有较好的稳定性及安全性，其在日用品中能作为化妆品的着色剂，还能在牙膏中使用且对治疗口腔疾病也有一定帮助[20]。此外，在医药方面它还具有加快伤口愈合、治疗胃溃疡的功能且有研究表明其对肿瘤也具有一定的抑制作用[21]，因此叶绿素铜钠盐具有广阔的应用前景。

4 结论

通过本研究可知，与叶绿素锌钠盐相比，叶绿素铜钠盐具有更高的光、热及酸碱稳定性；与叶绿素铜钠盐相比，叶绿素锌钠盐对氧化还原剂及食品添加剂的稳定性更好，两种水溶性钠盐分别具有补充铜制剂和锌制剂的功能。整体而言，叶绿素铜钠盐的稳定性更好，更适合应用于食品和日用品中，且通过前期实验得出叶绿素钠盐相较脂溶性绿色素的稳定性均明显提高。因此在保存叶绿素铜、锌钠盐时应避光保存并避免强酸条件，铜钠盐还需避免高浓度氧化还原剂条件。叶绿素铜、锌钠盐在食品中应用不仅能增加外观，而且能提高其产品功能。