重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗对麻鸭和番鸭免疫效果观察

陈渊泉

（仙游县畜牧兽医局，福建仙游 351200）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种禽类传染病，不仅对养禽业造成严重危害，而且具有重要公共卫生学意义[1]。AIV 是一种单股负链分节段的RNA 病毒，其基因组由PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS8 个基因片段组成，编码11 种蛋白。根据AIV 表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，其可进一步分为若干亚型。目前除在蝙蝠中发现的两种新亚型A 型流感病毒（H17N10 和H18N11）外，其余的16 种HA 亚型和9 种NA 亚型均能在野禽或家禽中分离到[2]。20世纪90 年代中期以前，鸭和鹅等水禽被认为仅携带AIV，可排毒但不发病。但之后的研究[3]发现，水禽不仅是AIV 的天然贮存库，同时其本身也已成为对AIV 高度易感、高发病率与高死亡率的禽类。家禽和野生鸟类的H5N1 AIV 疫情长期监控数据[4]显示，我国南方鸭群H5 亚型AIV 阳性率较高，表明H5N1 AIV 在水禽中往往表现低致病性，并通过“水禽—陆生家禽—水禽”循环维持病毒存在，促成了H5N1 AIV 的传播。2017 年初，H7N9 高致病性AIV 在广东省出现，并很快形成9 种基因型，虽然接种疫苗减少了感染，但一些H7N9 AIV 对鸭的致病性有逐渐增强趋势[5-6]。因此，水禽（鸭）在AI 的发生、传播、流行及病毒变异和跨种传播中起着重要作用，而疫苗免疫仍是加强水禽AI 疫情防控的首选策略[7]。

临床研究[8]表明，接种重组灭活疫苗对预防我国养殖水禽高致病性AI 具有十分积极的意义。种鹅和蛋鸭在14 日龄接种重组AIV（H5N1 Re-11株+Re-12 株，H7N9 Re-2 株）三价灭活疫苗，在45 日龄进行二次免疫后，产生的H5N1 Re-11/Re-12 株、H7N9 Re-2 株抗体滴度都较高，对产蛋前种鹅和蛋鸭都有较好的保护力[9]。石永胜等[10]评价重组AIV 灭活疫苗鸡胚源H5N1 Re-6 株、鸡胚源H5N1 Re-6+Re-8 株、细胞源Re-6+Re-8 株及水禽专用H5N2 D7 株等4 个产品对番鸭的免疫效果，发现4 种疫苗免疫效果由高至低依次为鸡胚源H5N1 Re-6+Re-8 株、细胞源Re-6+Re-8 株、H5N2 D7 株、鸡胚源H5N1 Re-6 株。另外，不同剂量AIV 疫苗免疫肉鸭的效果分析[11]表明，加大免疫剂量并不能使麻鸭AIV 抗体效价增加，严格按照生产厂家的说明使用剂量足量接种即可达到免疫效果要求。我国强制免疫的亚型主要是H5N6、H7N9、H5N1。但各亚型也会随着时间推移发生进化，比如2017 年农业部决定全国统一用重组AIV二价灭活疫苗（H5N1 Re-8+H7N9 H7-Re1 株）替代H5 二价或三价灭活疫苗[12]，2018 年又决定全国统一使用重组AIV 三价灭活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）[13]。

本研究采用重组AIV（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）三价灭活疫苗进行了麻鸭与番鸭免疫试验，对免疫麻鸭和番鸭的抗体水平进行了动态监测，旨在为该疫苗的进一步推广应用以及水禽AI 免疫程序的制定提供数据支撑与理论依据。

1 材料

1.1 试验水禽

莆田麻鸭、番鸭各120 羽，在选定的养殖场内按常规方法饲养至出栏。

1.2 试验疫苗

重组AIV（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株），由莆田 市仙游县动物疾病预防控制中心提供，批号为190084900，购自青岛易邦生物工程有限公司。

1.3 检测试剂

AIV 血凝抑制（HI）试验抗原H5 亚型（Re-11、Re-12 株）、H7 亚型（Re-2 株）以及相应的标准阴阳性血清，由哈尔滨国生生物科技股份有限公司提供。

2 方法

2.1 麻鸭免疫试验

选取120 羽21 日龄的莆田麻鸭（AIV 母源抗体均衰减至4log2 以下），随机均分成3 组（一免组、二免组、对照组）。将重组AIV（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）参照国家动物疫病强制免疫指导意见（2022—2025年）以及福建省蛋鸭疫苗免疫程序[14-15]开展免疫。一免组于21 日龄免疫1 次，剂量为1.0 mL/羽，采用颈部皮下免疫注射；二免组分别于21、35 日龄各免疫1 次，剂量均为1.0 mL/羽，颈部皮下注射；对照组麻鸭不免疫。

2.2 番鸭免疫试验

120 羽孵化至21 日龄的莆田番鸭（AIV 母源抗体均衰减至4log2 以下），随机均分成3 组（一免组、二免组、对照组）。参照国家动物疫病强制免疫指导意见（2022—2025 年）以及福建省蛋鸭疫苗免疫程序[14-15]，将重组AIV（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）按推荐剂量进行免疫接种，一免组于21 日龄免疫1 次，剂量为0.5 mL/羽，颈部皮下注射；二免组分别于21、35 日龄各免疫1 次，剂量分别为0.5、1.0 mL/羽，颈部皮下注射；对照组番鸭不免疫。

2.3 抗体检测

试验水禽（麻鸭、番鸭）于21 日龄接种重组AIV 疫苗前分别翅静脉采血2.0 mL/羽，接种疫苗后分别于35、49、63 日龄采集血样。按照常规方法分离血清，用于统一检测H5 和H7 亚型AIV HI抗体滴度。

根据国家标准《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2003）中HI 试验方法，对同一份血清样品检测H5N1 Re-11、Re-12 株和H7N9 Re-2株HI 抗体滴度。按照国家动物疫病强制免疫计划要求，待检样品血清HI 抗体滴度≥4.00log2 判定为抗体合格，合格率（抗体合格的样品数占同组样品总数的比率）≥70%为群体免疫合格。

2.4 统计分析

试验数据采用Microsoft Excel 软件进行整理，应用GraphPad Prism 7 软件进行统计分析。

3 结果

3.1 麻鸭免疫效力试验

3.1.1 重组AIV 三价灭活疫苗HI 抗体效价检测疫苗免疫后，麻鸭血清中H5N1 Re-11、Re-12 株和H7N9 Re-2 株HI 抗体滴度消长动态分别见图1～3。一免组、二免组麻鸭在35、49、63 日龄，3 种抗体平均水平总体均呈上升趋势，且二免组各日龄抗体水平均高于一免组。一免组麻鸭在35、49、63 日龄产生的H5N1（Re-11、Re-12 株）和H7N9 Re-2 株HI 抗体效价均低于5.70log2，二免组麻鸭针对三种抗原的抗体滴度均大于6.00log2。一免组、二免组麻鸭在35 日龄3 种抗体滴度均分别达到5.00log2、6.00log2 以上；二免组麻鸭在49、63 日龄3 种抗体滴度均大于7.00log2；对照组麻鸭血清中3 种抗体滴度均低于保护临界值（4.00log2）。

3.1.2 抗体平均合格率 重组AIV 三价灭活疫苗免疫后，麻鸭抗体平均合格率检测结果（图4～6）显示：一免、二免组麻鸭在35、49、63 日龄3 种抗体平均合格率均呈上升趋势，均超过农业农村部要求的最低标准（70%），且二免组麻鸭各日龄抗体平均合格率均高于一免组；一免组麻鸭在35、49、63 日龄产生的3 种抗体平均合格率为73%～89%，二免组均大于86%，对照组则均低于10%。

3.2 番鸭免疫效力试验

3.2.1 重组AIV 三价灭活疫苗HI 抗体效价检测 疫苗免疫接种后，一免组番鸭在35、49、63 日龄3 种抗体平均滴度均高于5.50log2，在21～49 日龄之间均呈上升趋势，63 日龄后开始下降。二免组番鸭在35、49、63 日龄3 种抗体滴度均高于一免组，63 日龄时抗体水平仍保持在7.00log2 以上。对照组3 种抗体滴度均呈下降趋势，且均低于4.00log2。具体结果分别见表1～3。

3.2.2 抗体平均合格率 一免组、二免组番鸭在35、49、63 日龄时3 种抗体平均合格率均呈上升趋势；对照组番鸭抗体平均合格率在21 日龄仅为20%～60%，在35～63 日龄均降至0，具体结果分别见表1～3。

表1 番鸭H5N1 Re-11 株免疫抗体检测结果

4 讨论

H5 与H7 亚型AIV 的自然宿主依旧以禽类为主，而水禽在AIV 传播中发挥了至关重要的作用[16]。在我国许多地区，存在水禽与鸡户外混养或水禽与鸡同场分隔饲养的现象[17]。因此要预防和消灭AI，控制水禽AI 是非常重要的一环。我国应用最广泛的AIV 疫苗为全病毒灭活疫苗，其优点在于安全性好，抗原组分齐全，免疫原性好，可诱导产生较高抗体效价，具有保护周期长等特点[18]。免疫抗体水平监测的准确性、可靠性、代表性等对高致病性AI（HPAI）防控起着非常关键的作用。本次水禽临床试验表明，重组AIV（H5+H7）三价灭活疫苗对麻鸭、番鸭均具有良好的免疫效果，可以满足临床生产需要，符合国家相关标准。

表2 番鸭H5N1 Re-12 株免疫抗体检测结果

表3 番鸭H7N9 Re-2 株免疫抗体检测结果

目前在我国，特别是在商品化禽类养殖密度高的地区，针对HPAI 的非疫苗接种控制措施成本非常高。AIV 油乳剂灭活疫苗可用于鸭群二次免疫加强接种，会产生更高更持久的免疫抗体，以防止在秋冬季高发季节暴发AI 疫情。鸭群HPAI 免疫一般需要2 次接种才能得到较高的免疫抗体水平，种鸭产生的免疫抗体可通过卵黄传递给雏鸭，起到天然被动免疫作用，保护雏鸭免受AIV 侵袭。因此水禽AIV 疫苗免疫时机、剂量选择显得尤为重要。研究[19,20]表明，重组AIV（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）三价灭活疫苗对鸡、鸭具有良好免疫效果，大部分家禽机体内能同时产生H5、H7 免疫抗体。本次麻鸭临床试验结果表明，二免剂量达到1.0 mL 的免疫效果更好。试验番鸭免疫重组AIV 三价灭活疫苗后，免疫番鸭在35 日龄抗体合格率就达到90%，超过了国家强制免疫的群体合格率标准（70%）。试验表明，该疫苗能够刺激番鸭产生有效免疫保护抗体，适用于番鸭免疫预防。一免组番鸭的平均免疫抗体滴度呈现先升后降趋势，说明一次免疫的抗体持续时间较短。相比而言，二免组番鸭免疫抗体持续上升，3 种抗体平均免疫滴度均高于一免组，同时二次免疫的抗体持续时间优于一免组。

相对于养殖陆生禽，水禽H5N1（Re-11、Re-12 株）、H7N9（Re-2 株）产生的抗体滴度相对低一些，因此临床上对蛋鸭免疫AIV 疫苗时建议适当增加免疫剂量，推荐一免与二免的免疫总量达到1.5～2.0 mL。我国水禽饲养量大，饲养水禽与候鸟经常共享同一水系，商品鸭感染野鸟源AIV的概率较高，因此除了进行科学有效的疫苗免疫外，还应重视推行生物安全饲养模式，真正从防控水禽AI 的传染源、传播途径与易感宿主等3 个方面有计划分步骤着手开展HPAI的监测与免疫预防工作。

本研究分别选择21 日龄麻鸭和番鸭各120羽，分组进行了重组AIV（H5N1 Re-11+Re-12 株、H7N9 Re-2 株）三价灭活疫苗免疫试验，对各免疫组与对照组麻鸭、番鸭在不同日龄进行HI 平均抗体水平检测。研究表明，两次免疫对于提高AIV（H5+H7）三价灭活疫苗的免疫效果，弥补免疫空白期，提升AIV 特异性免疫抗体，尽早发挥临床保护作用具有重要意义。