固定化Co(salen)/固定化漆酶协同催化增强木素抗氧化性能研究

肖娅楠，周学飞

(昆明理工大学 化学工程学院，云南 昆明 650500)

0 引 言

木素是自然界中最丰富的天然酚类聚合物，其来源丰富且可再生.众多的官能团和独特的结构，赋予了木素抗氧化性、抗癌变、抗诱变等生物活性，是一种天然的抗氧化剂[1]，而且工业木素成本低廉，属于绿色化工原料，能够利用其制备多种高附加值的化学品.近年来，科学工作者在降解木素方面作了不少努力，木素降解主要是通过弱化和断裂木素结构中的化学键，或使其产生一些易于反应的基团或活性位点，来提高木素的反应活性，从而实现木素降解[2].目前，木素的降解方法主要有热解、氢解、生物酶降解等方法.其中，生物酶降解因其专一性强和环境友好具有很好的发展前景[3].漆酶是生物酶的一种，它从酚羟基取代一个电子催化底物中的酚型结构，进而使木素聚合或降解.然而，漆酶的实际应用受限于其稳定性低、利用率低、成本高等缺点.为了增加漆酶的可用性，研究者将漆酶固载于载体上，既克服了游离酶的缺点，又保持了酶的活性，同时还呈现出易分离、可重复利用等优点[4].Liu等[5]以碳球为载体固定漆酶，结果发现，固定化漆酶活性高达91%，对酚类化合物的降解效率可达84%.金属(salen)配合物的活性中心与生物酶相似且易合成、选择性好，因此其在木素降解领域有着很大的应用前景[6], Badamali等[7]将 Co(salen)配合物固定在硅质SBA-15上，在微波加热条件下,可以选择性地将型木素模型化合物二聚体降解为2-甲氧基苯酚.

木素本身含有的羟基，使其具有一定的抗氧化性能，能够应用到抗氧化剂等多种领域.但木素大分子复杂的结构限制了其应用前景，且催化剂的单独使用难以使木素大分子得到高效碎解[8]，本文采用固定化Co(salen)和固定化漆酶协同催化降解硫酸盐木素，以增强其抗氧化性能，为实现其绿色、高效发展奠定理论基础.

1 实 验

1.1 材 料

硫酸盐木素由所在课题组提供.游离漆酶酶活为277.8 U/g.采用沉积法将Co(salen)和漆酶固定在氧化石墨烯上[9]，利用ICP-OES测定固定化Co(selen)中Co含量，结果为10.6 mg/L.用ABTS方法测得固定后漆酶活性为24.7 U/g载体[10].

1.2 催化处理硫酸盐木素

分别以固定化Co(salen)、固定化漆酶和固定化Co(salen)/固定化漆酶为催化剂，30%H2O2为氧化剂进行硫酸盐木素催化实验.

第一步，比较单个催化剂催化与一锅法的效果.(1)过氧化氢+固定化Co(salen)+木素.反应时间1、2、3 h.温度为室温.H2O2用量3 mL，pH7(用pH值7的缓冲溶液作为反应的溶液).硫酸盐木素100 mg，100 mL缓冲液.固定化Co(salen)8 mg.(2)过氧化氢+固定化漆酶+木素.反应时间1、2、3 h.温度为室温.H2O2用量3 mL，pH7(用pH值7的缓冲溶液作为反应的溶液).硫酸盐木素100 mg，100 mL缓冲液.固定化漆酶 8 mg.(3)过氧化氢+固定化Co(salen)/固定化漆酶+木素.反应时间1、2、3 h.温度为室温.H2O2用量3 mL，pH 7(用pH值7的缓冲溶液作为反应的溶液).硫酸盐木素100 mg，100 mL缓冲液.固定化Co(salen)4 mg/固定化漆酶4 mg(固定化Co(salen)∶固定化漆酶=1∶1).

第二步，采用正交试验优化一锅法的反应条件.六因素五水平正交表：L25(56)正交表.因素A：时间，1、2、3、4、5 h.因素B：30% H2O2用量，1、2、3、4、5 mL.因素C：pH，5、6、7、8、9.因素D：催化剂总用量，6、7、8、9、10 mg.因素E：固定化Co(salen)/固定化漆酶比例，3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3.因素F：硫酸盐木素用量，60、80、100、120、140 mg.

图1 一锅法催化与单个催化剂催化的比较Fig.1 Comparison of synergistic catalysis with single catalyst catalysis

第三步，以正交试验得到的反应条件为基础，采用单因素实验方法，进一步优化一锅法催化反应的条件.

1.3 紫外-分光光度计测定抗氧化性

吸光度测试条件：在波长557 nm处测定木素清除PTIO·时的吸光度.清除率按(1)式计算：

清除率=[(A0-A)/A0]×100%

(1)

式中：A0表示不加样品时的吸光度，A表示加入样品后的吸光度.

2 结果与讨论

2.1 协同催化与单独催化的效果比较

在课题组前几届毕业生研究的基础上，本论文仅研究固定化漆酶、固定化Co(salen)、固定化Co(salen)/固定化漆酶三种催化方式，实验结果如图1所示.

从图1中可以看出，协同催化剂的催化效果明显好于单独催化，说明两种催化剂之间有较好的协同作用[11]，能够破坏木素大分子的结构单元，使更多的羟基暴露出来，从而使其清除自由基的能力增强.

2.2 正交试验优化固定化Co(salen)/固定化漆酶协同催化木素

固定化Co(salen)/固定化漆酶催化硫酸盐木素以增强其抗氧化性能的正交实验方案及试验结果如表1所示.

表1 正交实验设计及结果分析

从正交实验分析结果表中可知，不同因素对木素抗氧化性能的影响是不一样的，影响程度依次为：C>D>B>F>A>E，以木素捕获PTIO·自由基的能力为指标，得出正交实验催化增强木素抗氧化性能的最有条件为：A3B3C1D1E5F5；即反应时间为3 h，30%H2O2用量为3 mL，pH值为5，催化剂用量为6 mg，催化剂比例为1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量为140 mg.

2.3 单因素实验进一步优化

正交实验具有布点均衡、整齐可比等特点，能够在较少的实验次数中得到较优的方案[12]，而且每个因素水平都出现相同的次数，能够消除部分实验误差带来的干扰，但正交实验得出的优选结果还是在所取水平的范围之内，进一步实验的指向性不是十分明确.因此，为了有效解决正交实验局限性，以正交试验得到的反应条件为基础，采用单因素实验方法优化协同催化反应的条件，进一步增强木素的抗氧化性能.

2.3.1 反应时间的影响

图2 反应时间的影响Fig.2 The effect of reaction time

在保证实验结果尽可能好的前提下，缩短反应时间，能节约生产成本，更符合绿色化学的发展要求.根据正交实验结果反应时间的水平选取为：1～5，实验条件为：H2O2用量为3 mL，pH 为5，催化剂用量为6 mg，催化剂比例为1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量为140 mg.缓冲溶液100 mL.实验结果如图2所示，反应时间从1 h到2 h过程中，木素清除自由基能力逐渐增强，在2 h时即可达27.05%的清除率，与两种催化剂单独使用相比，两种催化剂协同使用能够缩短反应时间.在2 h到4 h之间自由基清除率大幅下降，这可能是因为随着反应时间的增长，催化剂结构被破坏而使其失活，导致硫酸盐木素的自由基清除率随着下降.

2.3.2 H2O2用量的影响

图3 H2O2用量的影响Fig.3 The effect of H2O2 dosage

H2O2在反应过程中产生亲核性极强的过氧化氢负离子HOO-作用于木素大分子[13]，使木素侧链碎解，产生更多的羟基，使其自由基清除率增加.此外，H2O2还能与反应中的Co(salen)发生作用，形成超氧配合物，进一步作用于木素，使木素碎解[14].实验条件为：pH值为5，催化剂用量为6 mg，催化剂比例为1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量为140 mg，反应时间2 h，缓冲液100 mL.如图3所示，30%H2O2用量从2 mL到4 mL，木素的自由基清除能力逐渐增加，这说明增加H2O2的用量，对增强木素的抗氧化性能是有利的.但当H2O2用量超过4 mL时，木素的自由基清除率基本不变，这可能是因为此时反应已经达到饱和状态，继续增加H2O2用量，木素结构不再发生变化[15]，进而自由基清除率也不会发生变化，从经济成本角度看，H2O2用量选择3 mL为宜.

2.3.3 pH值的影响

图4 pH值的影响Fig.4 The effect of pH

pH值是影响催化反应实验结果的一个重要因素，因此对其进行探究，实验结果如图4所示，体系pH值从5增加到8时，木素自由基清除率明显增加，但当pH值超过8时，自由基清除率大幅下降，这是因为体系中pH值增加有利于H2O2异裂分解产生HOO-,加快木素大分子结构碎解，进而增加其自由基清除率，而当体系中pH值超过8，会造成HOO-的无效分解，失去氧化作用;另一方面，pH值过大，会超过漆酶和Co(salen)的最适pH值，从而影响催化剂的活性，导致木素降解效果变差[16]，削弱了清除木素自由基的能力.因此pH值选择8最合适.

2.3.4 催化剂总用量的影响

图5 催化剂总用量的影响Fig.5 The effect of total amount of catalyst

实验条件为：pH值8，催化剂比例为1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，木素用量为140 mg，反应时间2 h，30% H2O2用量4 mL，缓冲液100 mL.从图5中我们可以看出，随着催化剂用量的增加，木素自由基清除率整体呈先增加后降低的趋势，在催化剂添加量为0时，木素自由基清除率仅为22.08%，当催化剂用量增加到6 mg时，清除率可达64.71%，这表明在反应体系中加入固定化Co(salen)和固定化漆酶能使木素捕获自由基的能力显著提升.然而当催化剂总用量超过6 mg时，清除率呈现下降趋势，此时H2O2被体系中过量的催化剂无效分解，木素碎解效率被削弱[17].因此催化剂总用量最佳选择为6 mg.

图6 催化剂比例的影响Fig.6 The effect of catalyst ratio

2.3.5 催化剂比例的影响

在协同催化反应中，催化剂比例在很大程度上影响着反应速率和木素的碎解效果[18].实验条件为：pH值8，催化剂总用量6 mg，木素用量为140 mg，反应时间2 h，30% H2O2用量 4 mL，缓冲液100 mL.

结果如图6所示，当固定化Co(salen)的用量多于固定化漆酶时，即漆酶用量少时，催化反应的专一性变差，对木素醚键降解的专一性减少，酚羟基减少，木素自由基清除率下降[19].当固定化漆酶用量多于固定化Co(salen)时，催化反应的专一性增强，对木素醚键降解的专一性增强，酚羟基增加，清除率提高.固定化Co(salen)∶固定化漆酶选择1∶3最佳.

2.3.6 木素用量的影响

图7 木素用量的影响Fig.7 The effect of lignin dosage

实验条件为：pH值8，催化剂总用量6 mg，催化剂比例为1∶3(固定化Co(salen)∶固定化漆酶)，反应时间2 h，30% H2O2用量4 mL，缓冲液100 mL.如图7所示，木素用量对清除木素自由基能力的影响大体呈先增大后减小的趋势，这是由于木素用量少时，产生的羟基少，从而自由基清除率就低，随着木素的增加，催化剂和木素充分反应，木素大分子结构上的羟基被释放出来，捕获自由基能力相应增强，但当木素用量过多时，单位木素量的催化剂用量变少，催化效果减弱，木素醚键断裂减弱，酚羟基变少，捕获自由基能力下降.

3 结 论

通过对固定化Co(salen)/固定化漆酶协同催化增强木素抗氧化性能工艺条件的初步探究，得出以下结论：

1) 固定化Co(salen)与固定化漆酶协同催化对增强其抗氧化性能的效果明显优于单一催化剂；

2) 固定化Co(salen)与固定化漆酶协同催化对增强其抗氧化性能的最佳工艺条件为：反应时间2 h，H2O2用量4 mL，pH值8，催化剂总用量6 mg，催化剂比例1∶3，木素用量140 mg；

3) 在最佳条件下，固定化Co(salen)/固定化漆酶协同催化，可使木素的自由基清除率达到64.71%.