石菖蒲、远志及其配伍对ox−LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤的影响

陈志宁 刘晓俊 唐梁 梁伟海 林国伟

广州市第一人民医院中医科，广州 511458

脑卒中是最常见的脑血管病之一。脑卒中患者不仅会有运动及感觉方面出现障碍，还可能出现认知功能障碍［1］。根据卒中后认知障碍（PSCI）的临床表现，中医主要诊断为“痴呆”，全国名老中医刘茂才教授经长期临床工作总结出痴复康方，用于治疗认知功能障碍患者。研究表明，痴复康方无论在临床或实验中均有明显的疗效［2−3］。石菖蒲、远志为痴复康方成分之一，石菖蒲具有开窍豁痰、醒神益智之功，远志有养血宁心、散痰涎之功，均为治疗痴呆的常用中药。血管内皮细胞功能发生障碍是动脉粥样硬化的起始环节，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low−density lipoprotein，ox−LDL）可促进动脉粥样硬化的进展［4］。2021年1月至8月，本实验选取痴复康方中的石菖蒲、远志，探讨其对ox−LDL损伤人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的影响，进一步探讨痴复康方的机制。

材料与方法

1、主要材料和仪器

1.1、材料 石菖蒲、远志（广州市药材公司中药饮片厂，批号：YPA8C0001，YPA8G0002）；ox−LDL（广州奕元生物技术公司，批号YB−002）；胎牛蛋白（美国Gibco公司，批号1027−106）；胰蛋白酶（武汉博士德生物公司，批号PYG14190）；Propidium Iodide/碘化丙啶（上海碧云天生物技术公司，批号ST512）；RNase A酶（美国SIGMA公司，批号R4875；高纯总RNA快速提取试剂盒（美国BIOTEKE公司，批号BP1201）；HiScriptⅡQRTSuperMix for qPCR（+gDNA）（美 国Vazyme公 司，批 号R223−01）；HieffTMqPCR SYBP®Green Master Mix（LoW Rox Plus）（上海翊圣生物公司，批号11202ES08）；DL2000 DNA marker（美国TAKARA公司，批号3427B）；DMEM培养基（美国HyClone公司，批号SH30809.01B）；PBS粉剂（武汉博士德生物公司，批号1027−106）；CCK−8试剂盒（碧云天）；trypsin−EDTA溶液（BIOSHARP，批号WH0518）；双抗（青霉素/链霉素原液）（TBD，批号PS2004HY）；Annexin V−APC/7AADkit：（联科生物，批号4224750）。

1.2、仪器 CW−CJ−2F型净化工作台（苏州净化有限公司）；水套式二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；普通光学显微镜（日本尼康公司）；多功能酶标仪（美国Thermo公司）；流式分析仪（爱森生物有限公司）；水平离心机（湖南湘义离心机仪器有限公司）；涡旋混匀器（其林贝尔仪器制造有限公司）；荧光定量PCR仪（杭州博日科技公司）；Tanon−1600凝胶成像系统（上海天能科技公司）；JY200C电泳仪（北京君意电泳设备公司）；超微量核算分析仪Nano−200（杭州奥盛仪器公司）。

1.3、HUVECs培养 无菌条件下，取新生儿脐带，用0.25%胰酶注入静脉腔内消化静脉内皮8 min，收集消化液放至含1 ml血清的离心管，1 000 r/min离心7 min，弃上清液，混匀后放置培养箱（37℃，5%CO2）培养24 h，再次换液，待细胞融合后用0.05%胰酶进行细胞消化传代，培养后置于培养箱（37℃，5%CO2）待用。

2、石菖蒲、远志对ox−LDL诱导HUVECs增殖和相对活率的影响

在96孔板中接种2 000个HUVECs悬液（100.0μl/孔），置于培养箱中预培养24 h（37℃，5%CO2），弃上清，用PBS缓冲液洗2次，随机分成5组：空白组（正常培养的HUVECs），模型组（加入80μg/ml ox−LDL的培养液），样品组［加入80μg/ml ox−LDL的培养液及不同浓度（5、10、20 mg/ml）的石菖蒲、远志或石菖蒲+远志的DMEM培养液］。将其置于培养箱中培养48 h，每孔加入10.0μl CCK−8溶液，培养箱内孵育0.5～1.0 h，最后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度检测各孔的光密度值（A）。

3、HUVECs凋亡的测定

细胞消化，收集药物处理后的细胞，PBS、1×Binding Buffer依次洗1次，取细胞悬液，重悬细胞，随机分成5组，每组设3个复孔：空白组（正常培养的HUVEC），模型组（空白对照组中加入80μg/ml ox−LDL诱导），石菖蒲组（模型组中加入5 mg/L石菖蒲水煎煮物），远志组（模型组中加入5 mg/ml远志水煮物），石菖蒲+远志组（模型组中加入5 mg/L的石菖蒲+远志水煎煮物）。石菖蒲组、远志组、石菖蒲+远志组加入水煮物的浓度均为细胞相对活率实验中得出的最佳浓度。每个样品中加入100.0μl 1×Binding Buffer，加入5.0μl Annexin V−APC和10μl 7AAD，混匀后室温下避光孵育15 min，再每管加入485.0μl预冷1×Binding Buffer重悬混合。流式细胞仪进行检测，使用Flowjo进行数据分析。

4、HUVECs周期的测定

取生长状况良好、密度适中的细胞，设5组，具体分组同上，每组设3个复孔，超净台上消化收集细胞，预冷的PBS液洗细胞2次。加预冷70%乙醇重悬，4℃环境下固定过夜，或−20℃长期固定待用；离心收集细胞，1 ml预冷PBS液洗细胞1次，加入500.0μl含5μg/ml碘化丙锭、0.2%Triton X−100、100μg/ml RNaseA的PBS，4℃避光培养30 min；流式细胞仪标准流程检测，保证计数1×105个细胞以上；结果用细胞周期拟合软件Flowjo分析。

5、实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法鉴定Bax、Bcl−2 mRNA的表达

取生长状况良好、密度适中的细胞，细胞分组同上，设5组，每组设3个复孔，引物设计见表1，提取总RNA，超净台上收集各组细胞沉淀，提取RNA，准备PCR反应管，依次在管中加入20.0μl反应体系，具体流程为7.4μl ddH2O在94℃下预变性1 min，10.0μl SYBR在94℃下变性15 s，1.0μl cDNA在60℃下退火20 s，1.6μl在72℃延伸20 s，变性、退火、延伸流程循环40次，结果用相对定量法进行分析。

6、统计学分析

实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。实验数据以(±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴定Bax、Bcl−2 mRNA的表达的引物设计

结 果

1、细胞增殖与细胞相对活率

模型组与空白组相比较，其相对活率下降，提示ox−LDL诱导细胞损伤模型制备成功。不同浓度的单种药组中，5 mg/ml石菖蒲、5 mg/ml远志细胞增殖OD值及细胞活率最佳；联合用药组以5 mg/ml的效果最优；其中，相同的药物浓度下，联合用药组细胞活率优于单种药。单药和联合用药，随着用药浓度增加，细胞相对活率均下降。此步骤得出石菖蒲低剂量组、远志低剂量组、石菖蒲+远志药对低剂量组为最佳浓度。见表2。

表2 石菖蒲、远志对ox−LDL诱导HUVECs增殖和相对活率的影响（±s）

表2 石菖蒲、远志对ox−LDL诱导HUVECs增殖和相对活率的影响（±s）

注：与空 白 组 比 较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；ox−LDL为氧化型低密度脂蛋白，HUVECs为人脐静脉内皮细胞；“−”表示无数据

组别空白组模型组石菖蒲低剂量组石菖蒲中剂量组石菖蒲高剂量组远志低剂量组远志中剂量组远志高剂量组石菖蒲远志药对低剂量组石菖蒲远志药对中剂量组石菖蒲远志药对高剂量组细胞增殖OD值0.899±0.003−0.973±0.008a 0.966±0.052a 0.878±0.042 0.977±0.012a 0.794±0.054a 0.605±0.025a 0.940±0.035 0.803±0.029a 0.544±0.017a细胞相对活率98.733±0.451 88.1±0.608a 93±0.721ab 89.567±2.237 83.9±4.014 93.4±1.114 75.9±5.142 57.8±2.339ab 103.06±2.815 76.767±2.730a 52.033±1.678ab

2、细胞凋亡

数据显示，模型组的凋亡率较空白组显著增高，提示模型制备成功。与模型组相比，石菖蒲组的凋亡率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；远志组、石菖蒲+远志组的凋亡率显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图1、表3。

图1 各组人脐静脉内皮细胞凋亡结果；A为空白组人脐静脉内皮细胞凋亡结果，B为模型组人脐静脉内皮细胞凋亡结果，C为石菖蒲组人脐静脉内皮细胞凋亡结果，D为远志组人脐静脉内皮细胞凋亡结果，E为石菖蒲+远志组人脐静脉内皮细胞凋亡结果

表3 各组人脐静脉内皮细胞凋亡率比较（±s）

表3 各组人脐静脉内皮细胞凋亡率比较（±s）

注：与空白组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别空白组模型组石菖蒲组远志组石菖蒲+远志组凋亡率（Q2+Q3%）0.338±0.001 4.319±0.124a 2.694±0.561ab 2.278±0.914ab 2.250±0.699ab

3、细胞周期

与空白组相比，模型组、石菖蒲组、远志组的（S+G2）%期降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组相比，石菖蒲组、远志组、石菖蒲+远志组的（S+G2）%期增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与石菖蒲组相比，石菖蒲+远志组的（S+G2）%期增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与远志组相比，石菖蒲+远志组的（S+G2）%期增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表4。

表4 各组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期比较（±s）

表4 各组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期比较（±s）

注：与空白组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别空白组模型组石菖蒲组远志组石菖蒲+远志组（S+G2）%64.145±3.033 42.745±4.052a 52.055±2.920ab 54.867±1.880ab 62.065±1.881b

4、Bax、Bcl−2 mRNA表达量

石菖蒲、远志及其配伍对ox−LDL诱导HUVECs下Bax、Bcl−2 mRNA的表达量与空白组相比，模型组的Bax mRNA表达量升高，Bcl−2表达量下降，提示模型制备成功。与模型组相比，石菖蒲组、远志组、石菖蒲+远志组的Bax mRNA表达量下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与模型组相比，石菖蒲组、远志组、石菖蒲+远志组的Bcl−2表达量升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表5。

表5 各组人脐静脉内皮细胞Bax、Bcl−2 mRNA表达量比较（±s）

表5 各组人脐静脉内皮细胞Bax、Bcl−2 mRNA表达量比较（±s）

注：与模型组比较，a P＜0.05

组别空白组模型组石菖蒲组远志组石菖蒲+远志组n3 3 3 3 3 Bax表达量0.373 3±0.040 4 1.040 0±0.020 0 0.856 7±0.068 1a 0.756 7±0.061 1a 0.623 3±0.030 6a Bcl−2表达量3.330 0±0.080 0 1.056 7±0.086 2 1.563 3±0.165 0a 1.940 0±0.045 8a 2.086 7±0.129 0a

讨 论

动脉粥样硬化是由多个因素作用下发生的慢性炎症过程，血液中的多种脂质均可对血管内皮造成损伤，尤其是低密度脂蛋白（LDL）发生氧化后对动脉粥样硬化的发生发展起到极其重要的作用［5］。由于动脉粥样硬化导致血管管腔狭窄甚至闭塞，从而出现缺血性脑卒中等血管性疾病［6］。有研究表明，缺血性脑卒中后的患者出现认知功能障碍的发生率可高达80.97%［7］。同时有研究表明，高脂血症可导致血管炎性反应，脑血流量调节功能受损，从而影响PSCI的发生［8］。因此，抑制高脂血症导致的血管内皮细胞损伤在PSCI患者中尤其重要。

图2 各组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期；A为空白组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期，B为模型组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期，C为石菖蒲组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期，D为远志组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期，E为石菖蒲+远志组人脐静脉内皮细胞（S+G2）%期

痴复康方是全国名老中医刘茂才教授数十年经验总结出的治疗痴呆的代表方，由石菖蒲、远志、天麻、法半夏、黄芪、当归、何首乌、紫河车、巴戟天等药物组成。石菖蒲具有开窍豁痰、醒神益智的功效，中药石菖蒲的主要有效成分为β−细辛醚，具有保护血管内皮、调血脂、降低血液黏度、抗血小板聚集等作用［9］。研究表明，β−细辛醚可有效抑制ox−LDL对ECV304的损伤［10］。还有研究显示，β−细辛醚减少细胞凋亡的机制可能是通过稳定线粒体膜来实现的［11］。远志具有养血宁心、散痰涎的功效，具有抗痴呆、脑保护等疗效［12］。远志的主要活性成分是远志皂苷元，具有抗氧化、抗衰老、改善阿尔茨海默病的药理作用［13−14］。石菖蒲−远志为常用的中药药对，现代药理学表明，其可通过多种成分、多个靶点、多条路径改善阿尔茨海默病［15］，同时可通过调节Aβ和自噬水平改善慢性颅脑低灌注［16］。

有研究表明，Bax与Bcl−2两种蛋白在细胞凋亡与生长周期中具有拮抗作用，Bcl−2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用［17］。研究可采用Bax与Bcl−2蛋白来评估血管内皮细胞受损情况［18］。本研究结果显示，ox−LDL损伤血管内皮细胞可使细胞凋亡率升高，细胞增殖下降。予适量石菖蒲、远志及其配伍水提物干预后可使细胞凋亡率下降，细胞增殖指数升高，同时Bax mRNA表达量下降、Bcl−2 mRNA的表达量升高，提示石菖蒲、远志及其配伍水提物可能通过调控两种凋亡蛋白的表达来抑制血管内皮细胞的凋亡。

本实验中，通过对痴呆复康方拆方，探讨石菖蒲、远志及其药对配伍对血管内皮细胞的作用，认为石菖蒲、远志均对血管内皮细胞有保护作用，其配伍药对优于单味中药。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突