不同pH环境对胃上皮细胞系GES-1蛋白质组的影响

施韵 张玉娟

【摘要】目的：探讨不同 pH 环境对胃上皮细胞系 GES-1蛋白质组的影响。方法：购置胃上皮细胞 GSE-1系，分别放置在不同试管中，完成分组、标记。实验组试管细胞使用由浓盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）将培养基pH.调节至6.8（酸性）、9.4（碱性），未经调配的 RPMI.1640（pH.7.4）作为对照组，将 GES-1置于酸性、对照组、碱性3种pH.下培养。完成三组细胞总蛋白的提取，用 TMT（Tandem.Mass.Tags）技术对 GSE-1细胞蛋白质组进行分析。借助搜库软件 Proteome.Discoverer.2.4（PD2.4，Thermo）检索不同 run 的图谱，根据检索结果实现蛋白质的鉴定与定量。结果：相同初始细胞量的GES-1在pH.6.8、.pH.7.4（CK）、pH.9.4条件下培养7.d后，细胞状态呈现出明显差异。而在 pH.9.4中培养的细胞，细胞形态略微变圆，细胞密集度与对照组比有所下降，但总体来说生长状况良好。与对照组比，在碱性环境中鉴定出的差异表达蛋白仅19个，其中只有1个为下调蛋白; GES-1在弱酸性环境下培养7.d 后蛋白质表达发生了较大变化，与对照组比共鉴定到136个差异表达蛋白，包含96个上调蛋白和40个下调蛋白。结论：胃上皮细胞 GES-1最适合在 pH.7.4的环境中生存，但是对碱性的耐受能力非常强，能在 pH.9.4的强碱性条件下保持较好的状态;而细胞对酸的耐受力相形见绌，仅仅在 pH.6.8的影响下便难以维持正常的生命活动，多与不同环境下细胞的功能等有关。

【关键词】环境 pH;胃上皮细胞; TMT 定量蛋白质组

【中图分类号】R573【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2022）06-0183-04

作为人体重要的消化器官，胃的重要性不言而喻。泌酸是胃消化过程中独特而重要的环节[1]，与人体其他部位比，胃部环境 pH 波动幅度大（pH 参考值2.0～7.4）[2]，某些物质或药物可破坏胃黏膜屏障， H+迅速向黏膜内侵袭，引起一系列病理：当人体胃部组织中分泌的胃酸过多，则会引起胃受损，增加胃溃疡等疾病发生率;而胃酸缺乏，细菌容易在胃内过度繁殖，进而引发各种慢性胃黏膜炎病变[3]。同时，多种胃部疾病反过来也会影响胃酸分泌。胃癌属于发病率较高的消化道恶性肿瘤，且近年来疾病发生率呈上升趋势。既往研究表明，造成我国胃癌高发的主要原因包括幽门螺杆菌感染（HP）、遗传因素、饮食习惯、长期精神压力大等。现有研究表明，胃癌发生与胃内低酸环境相关[4]，随胃癌病期进展，肿瘤增大，各种亚型的胃癌无酸率均逐渐升高[5]。胃酸改变是胃部疾病的重要特征，因此，本研究在体外模拟了酸碱度改变后人胃黏膜上皮细胞株（GES-1）蛋白质组表达情况的变化，以期从分子角度揭示胃酸对胃黏膜细胞的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器与设备

二氯化钴，购自于Sigma 公司;胎牛血清、 DMEM 培养液，购自于 Gibco公司;台式高速低温离心机，购自于德国Herolab公司; Bradford 蛋白质定量试剂盒，购自于碧云天;基因扩增仪，型号Proflex，购自于 Life  Technologies 公司; Qubit 荧光计，型号： Qubit3.0，购自于 Life Technologies 公司;台式高速低温离心机，购自于德国Herolab公司;离心浓缩系统， DNA120，购自于德国 LEICA公司;蛋白酶抑制剂、 HPLC 水、能量吸收分子-芥子酸，购自于美国 Sigma 公司;细胞培养基，含有5%胎牛血清、1%间充质干细胞生长因子、1%青链霉素双抗，购自于美国ScienCell公司。

1.2细胞培养

胃上皮细胞 GSE-1来自美国模式培养物集存库（ATCC），在添加有10%胎牛血清、100×青霉素-链霉素的RPMI 1640（pH 7.4）培养基中于37℃、5%CO2中培养，将细胞分别放置在不同试管中，完成分组、标记。

实验组试管细胞使用由浓盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）将培养基 pH 调节至6.8（酸性）、9.4（堿性），未经调配的RPMI 1640（pH 7.4）作为对照组，将 GES-1置于酸性、对照组、碱性3种 pH 下培养，每种 pH 各3个重复，7 d 后用胰酶消化，收集细胞沉淀进行蛋白质组测序，上述所有操作严格遵循仪器与试剂盒说明书完成。

1.3总蛋白提取

从-80°C冰箱取出样本，转移到1.5 mL离心管中，胰酶消化后收集细胞，采用冰预冷PBS 完成细胞2次清洗，向细胞中加入100μL Western 及 IP裂解液，并加入预先配制好的DB蛋白溶解液（pH=8.5）;充分振荡后混合均匀;待上述操作完毕后，放置在超声冰水浴中，连续完成裂解5 min，离心15 min，速度为12000 g，设定离心温度为4℃，操作结束后取上清，加入DTT10 mM，在56℃下完成1 h反应，加入足量IAM，1 h避光反应[6-8]。使用 Bradford 蛋白质定量试剂盒（购自碧云天）进行质量检测，上述所有操作均按照Thermo  BCA Protein Assay 蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，并于96孔板中制作标准曲线，保证线性系数在0.95以上，待测样品设置两个复孔，于37℃恒温箱中连续进行30min 孵育，然后于酶标仪中570 nm 波长下读取吸亮度，根据标准曲线换算出蛋白样品浓度。

1.4蛋白质组分析

用 TMT（Tandem Mass Tags）技术对GSE-1细胞蛋白质组进行分析。取蛋白样品，酶切后标记TMT（购自Thermo）[9]。使用 L-3000 HPLC 系统进行馏分分离，色谱柱为Waters BEH C18（4.6×250 mm，5μm），柱温设为45°C。液质检测使用 Q ExactiveTM HF-X质谱仪（购自Thermo），NanosprayFlexTM（ESI）离子源，设定离子喷雾电压为2.1 kV，离子传输管温度为320°C。选取全扫描中离子强度TOP 40的母离子使用高能碰撞裂解（HCD）方法碎裂，进行二级质谱检测，二级质谱分辨率设为30000（200 m/z），C-trap最大容量为5×104，C-trap最大注入时间为54 ms，肽段碎裂碰撞能量设为32%，阈强度设为1.2×105，动态排阻范围设为20 s。

1.5蛋白质鉴定与定量

借助搜库软件Proteome Discoverer 2.4（PD2.4，Thermo）检索不同 run 的图谱，根据检索结果实现蛋白质的鉴定与定量。对于检索可信度>99%的谱肽（PSMs）称为可信PSMs。可信PSMs 中需至少包括一个特有肽段的蛋白质（称为可信蛋白）。保留可信谱肽和可信蛋白并进行验证;去除不符合要求的肽段和蛋白。借助T-tes t 检验完成蛋白质的定量分析，对于两组定量存在差异的蛋白称为差异表达蛋白（DEP）。本实验选择FC≥1.5（P ≤0.05）的蛋白为上调表达蛋白， FC≤0.67（P ≤0.05）的蛋白为下调表达蛋白，同时使用interproscan软件对差异表达蛋白进行GO富集分析[10-11]。

1.6统计分析

采用 SPSS 24.0软件处理。计数资料行χ2检验，采用[ n（%）]表示;计量资料行 t 检验，采用（±s）表示。若 P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同pH条件下GES-1的生长状态

相同初始细胞量的 GES-1在 pH 6.8、pH 7.4（CK）、 pH 9.4条件下培养7 d后，细胞状态呈现出明显差异。见图1。

RPMI 1640原本的 pH 值为7.4，以此作为对照组，在该条件下，胃上皮细胞形态正常，生长状况良好，细胞密集度较高。而在 pH 9.4中培养的细胞，细胞形态略微变圆，细胞密集度与对照组比有所下降，但总体来说生长状况良好。相比之下，细胞在 pH 6.8中培养后形态变化巨大，与两外两种条件下的细胞生长状况比有肉眼可见的差异，细胞状态整体较差，大部分细胞趋近于变圆、死亡，细胞数量也更少。这一结果表明，胃上皮细胞 GES-1最适合在 pH 7.4的环境中生存，但是对碱性的耐受能力非常强，能在 pH 9.4的强碱性条件下保持较好的状态;同时，细胞对酸的耐受力相形见绌，仅仅在 pH 6.8的影响下便难以维持正常的生命活动，这一现象佐证了胃癌发生与胃内低酸环境相关。

2.2 TMT定量质谱分析

TMT技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N 末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，共鉴定出7564个蛋白质，差异表达蛋白如火山图所示，见图2。与对照组比，在碱性环境中鉴定出的差异表达蛋白仅19个，其中只有1个为下调蛋白; GES-1在弱酸性环境下培养7 d后蛋白质表达发生了较大变化，与对照组比共鉴定到136个差异表达蛋白，包含96个上调蛋白和40个下调蛋白。以上定量质谱结果与细胞在三种环境下的生长状态相符合。

2.3差异蛋白GO富集分析

分别对在碱性、酸性环境中差异表达的蛋白质进行 GO 功能富集分析。在碱性环境中差异表达的蛋白与脂质、蛋白质等生物大分子的合成、运输、加工有关;在酸性环境中差异表达的蛋白倾向于膜蛋白，功能上通过改变氧化还原酶的活性来调控氧化还原过程，也与细胞的免疫应激相关，见图3。

3 讨论

酸碱平衡是人体维持内环境稳定的重要因素。对于正常细胞而言，细胞外液 pH 值为7.35～7.45[12]。但是，在一些病理或生理条件下，如：组织缺氧、酸中毒或碱中毒时， pH 能在6.5～8.1波动，并由此引起血管张力改变，增加疾病发生率。既往研究表明， pH 是通过细胞内 pH 值影响细胞代谢及信号传递途径，改变细胞的功能。胃是人体重要的消化器官，近年来随着人们生活方式的改变，导致胃癌发生率呈上升趋势。目前，胃癌是危害我国公共健康较为严重的恶性肿瘤之一，而我国最为胃癌高发国家，全球每年新发病例中，42%新发病例来自我国，发病人数超过40万人。多数胃癌由于症状不明显，确诊时常为晚期，导致患者临床治疗难度较大。因此，加强胃癌患者早期诊断及治疗成为当前研究热点。

国外学者研究表明[13]，胃癌的发生是一个多因素过程，除了与遗传因素有关外，亦与环境、生活方式存在紧密的联系。既往研究表明，肿瘤微环境是适合肿瘤细胞生長的内环境，环境中PH值等能直接参与疾病的发生、发展。因此，研究不同 pH 值环境对位上皮细胞增殖和蛋白质组的影响，能为临床制定干预措施提供参考依据。目前，临床上常见的胃部疾病较多，包括：胃溃疡、胃癌等，发病后部分患者伴有出血。但是，由于患者发病后胃酸分泌量较多，能对细胞增殖、生长的内环境产生影响[14]。本研究中，比较不同 pH 值下胃上皮细胞GES-1的生长状态，结果表明：胃上皮细胞 GES-1最适合在 pH 7.4的环境中生存，但是对碱性的耐受能力非常强，能在 pH 9.4的强碱性条件下保持较好的状态;同时，细胞对酸的耐受力相形见绌，仅仅在 pH 6.8的影响下便难以维持正常的生命活动。从本研究结果看出，胃癌的发生多与胃内低酸环境有关。出现这种现象主要是由于，酸性环境下回破坏抗原抗体反应的稳定性，能破坏红细胞的细胞膜，引起血红蛋白抗原消失，并对胃上皮细胞的增殖与生长产生影响，导致细胞发生突变，增加胃癌发生率。

定量蛋白质组学（TMT技术）属于是一种新型的技术，能实现基因组表达的全部蛋白，精准的鉴定、测量混合体系内的所有蛋白。目前， TMT技术广泛用于寻找或筛选差异性表达蛋白，揭示不同细胞的病理和生理功能与作用[15]。为了进一步分析不同 pH 环境对正常胃上皮细胞系 GES-1细胞蛋白质组的影响，本研究中引入TMT技术，结果表明：与对照组比，在碱性环境中鉴定出的差异表达蛋白仅19个，其中只有1个为下调蛋白; GES-1在弱酸性环境下培养7 d后蛋白质表达发生了较大变化，与对照组比共鉴定到136个差异表达蛋白，包含96个上调蛋白和40个下调蛋白。以上定量质谱结果与细胞在三种环境下的生长状态相符合，从本研究结果看出，弱酸性环境下，胃上皮细胞 GES-1蛋白发生明显的变化，而碱性环境中蛋白发生变化相对较少。此外，本研究中分别对在碱性、酸性环境中差异表达的蛋白质进行 GO功能富集分析，进一步验证不同 pH 环境下蛋白变化的原因，结果表明：对于碱性环境下胃上皮细胞 GES-1中差异蛋白相对较少，其蛋白差异可能与脂质、蛋白质等大分子的运输、合成及加工等有关。但是，在酸性环境下，差异蛋白数量较多，其功能亦发生明显变化，多与细胞在该环境下细胞免疫应激有关。

综上所述，胃上皮细胞GES-1最適合在 pH 7.4的环境中生存，但是对碱性的耐受能力非常强，能在 pH 9.4的强碱性条件下保持较好的状态;而细胞对酸的耐受力相形见绌，仅仅在pH 6.8的影响下便难以维持正常的生命活动，多与不同环境下细胞的功能等有关。

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（收稿日期：2021-11-15）