新型冠状病毒感染者6个月后抗体滴度分析

张卉，王文辉，卢佳，林凤杰，刘漫，刘璋，万鑫，郭靖，段凯，李新国

1.硚口区疾病预防控制中心，湖北 武汉430035；2.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉430207；3.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北武汉430207；4.湖北省疾病预防控制中心，湖北武汉430079；5.湖北省大悟县疾病预防控制中心，湖北孝感432800

WHO公布数据显示，截至2021年10月10日，全球新型冠状病毒肺炎（Ccoronavirus Disease 2019，COVID-19）累计确诊病例达236 599 025例，其中死亡病例4 831 486例［1］。COVID-19康复者抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）抗体持久性仍是科学家关心的问题。有研究者认为，SARS-CoV-2感染者体内诱导的体液免疫可能不会持久，无症状或症状轻微的个体可能会再次感染SARS-CoV-2［2-6］。本文对湖北省大悟县166例经医院确诊和疑似COVID-19患者康复出院6个月后抗SARS-CoV-2特异性IgG抗体及中和抗体滴度（EC50）进行分析，同时也对抗体阳性率及抗体持续时间进行初步分析。

1 材料与方法

1.1伦理及生物安全声明 根据湖北省疾病预防控制中心（湖北省预防医学科学院）伦理审查委员会批准的方案收集样本（批准编号：2020-068-02）。获得所有参与者签字的知情同意书。所有涉及SARSCoV-2的实验均在在中国科学院武汉病毒研究所生物安全3级（BSL3）实验室中进行。

1.2样本 于2020年9月由湖北省大悟县疾病预防控制中心采集大悟县166名疑似和确诊COVID-19患者康复出院6个月后血清样本，-20℃下运输至实验室并在检测前均冷冻保存。病例的诊断标准参考《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》，无症状感染者被定义为在观察期间体温＜37.5℃、核酸检测阳性、且无任何体征或症状（如无主观发热、肌痛、流鼻涕、喉咙痛、咳嗽、咳痰或胸部不适等）的感染者。

1.3细胞及疫苗原液 Vero细胞及新型冠状病毒疫苗原液（批号：202010Y002）均由武汉生物制品研究所有限责任公司提供。Vero细胞用含10%小牛血清的杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）培养。

1.4主要试剂 参考品由中国食品药品检定研究院提供，批号：SR20200304；小牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，批号：18070103；DMEM购自美国Gibco公司，批号：1953159；HRP标记的兔抗人酶标抗体由武汉生物制品研究所有限责任公司提供。

1.5抗S A R S-C o V-2中和抗体滴度的检测 采用蚀斑减少中和试验（plaque reduction eutralization test，PRNT）。将待检血清4倍系列稀释（1∶20~1∶5 120），在待检样品及参考品中加入600 PFU/mL的攻击病毒，0.3 mL/孔，37℃培养箱中和1 h；加至铺满单层Vero细胞的细胞培养板中，0.5 m L/孔，37℃培养箱吸附1 h；弃上清，加入含0.9%甲基纤维素的DMEM维持培养基，1 mL/孔，37℃培养箱培养3～5 d；一旦斑块形成并被肉眼确认，室温下用8%甲醛固定细胞60 min；6×亚甲蓝溶液对细胞染色1 h以上。中和效价计算：首先计算空斑对照所有复孔出现的空斑数目的平均值（X）、待检样品每个稀释度出现的空斑数目（M），1-M/X即为每个稀释度样品对中和用病毒的抑制效率。将数据输入GraphPad Prism计算50%病毒抑制效率的血清稀释度。中和抗体滴度（EC50）的计算需考虑梯度稀释血清与攻击病毒为等体积中和，中和效价为软件GraphPad Prism计算出的50%病毒抑制效率的血清稀释度乘以2之后取整数［7］。

1.6抗S A R S-C o V-2特异性IgG抗体滴度的检测采用ELISA法。用灭活新型冠状病毒疫苗原液（100 ng/100μL）包被96孔板，150μL/孔，4℃过夜；用含1%牛奶的PBS-T 37℃孵育1 h；将血清样品用稀释液（1%脱脂奶粉）稀释至20倍后，加至微孔板，孔内2倍系列稀释，100μL/孔，每个稀释度为单孔（1∶20~1∶2 560），设阴性对照、阳性血清对照1孔，100μL/孔，置恒温水浴箱37℃水浴1 h；洗涤液洗板5次，加入HRP标记的兔抗人酶标抗体（1∶20 000稀释），100μL/孔，置恒温水浴箱37℃水浴1 h；洗涤液洗板5次，按照先后顺序分别加入A、B两种显色液，各50μL/孔，混匀，置37℃水浴避光显色30 min；加入终止液，50μL/孔，450 nm/630 nm检测A值。以A值0.15为Cut-off值，待检样品A值≥Cut-off值的最高稀释倍数的倒数即为特异性IgG抗体滴度［7］。

1.7统计学分析 采用GraphPad Prism software version 7.0软件进行统计学分析。抗体滴度在所有统计过程之前均为对数变换，并被表示为几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）。EC50与特异性IgG抗体滴度间的相关性分析采用Pearson相关性分析。不同性别间阳性率的差异、不同症状组间的差异采用Mann-Whitney U检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1人群分布情况 共收集到166例自愿参与该研究的患者样本，其中男性81例（48.8%），平均年龄为49.6岁；女性85例（51.2%），平均年龄为52.9岁；有症状确诊病例101人，无症状确诊病例9人，疑似病例56人。

2.2抗体 166份样本的中和抗体及特异性IgG抗体滴度检测结果显示，抗体总阳性率分别为68.7%和77.7%，其中有症状确诊人群抗体总阳性率分别为82.2%和90.1%；无症状确诊人群抗体总阳性率分别为66.7%和88.9%；疑似人群抗体总阳性率分别为44.6%和53.6%。见表1。抗体GMT见表2。

表1 166例出院6个月COVID-19康复者血清中和抗体及IgG抗体阳性率Tab.1 Positive rates of neutralizing antibody and IgGin 116 patients with COVID-19 6 months after discharge from hospital

表2 166例出院6个月COVID-19康复者血清抗体GMTTab.2 GMTs of antibody in sera of 166 recovered patients from COVID-19 6 months after discharge from hospital

2.3中和抗体与IgG抗体的相关性 中和抗体滴度与特异性IgG抗体滴度间的相关性为93.0%，两者抗体检测方法高度相关，见图1。有症状确诊病例和疑似病例不同性别间的抗体阳转率采用Mann-Whitney U检验，抗体值取对数进行统计学分析，结果显示，不同性别间的中和抗体和IgG抗体差异无统计学意义（U=166，P＞0.05）。有症状确诊病例和无症状确诊病例间的中和抗体和IgG抗体差异无统计学意义（U=10，P＞0.05），而有症状确诊病例和疑似病例间的中和抗体和IgG抗体差异有统计学意义（U=159，P＜0.05）。见图2。

图1 中和抗体及特异性IgG抗体滴度间的相关性Fig.1 Relationship between titers of neutralizing antibody and specific IgG

图2 中和抗体（A、C）与特异性IgG抗体（B、D）滴度的检测Fig.2 Determination of titers of neutralizing antibody（A，C）and specific IgG（B，D）

3 讨论

SARS-CoV-2感染者体液免疫维持时间的研究对于预测新冠病毒疫苗群体免疫和解释血清流行病学数据至关重要。早期的一项研究表明，在感染早期抗体呈阳性的无症状人群中，通过化学发光免疫测定法检测，60%患者在2~3个月内抗体呈阳性［8］。有多项研究证实，在感染SARS-CoV-2 8个月后，采用3种试剂检测的抗体阳性率仍然较高，甚至在无症状或轻度症状感染者中也仍然较高（69.0%~91.4%）［9-11］。一项对2020年4—12月武汉市人群的研究数据表明，6.9%人群具有SARS-CoV-2抗体；在抗体阳性人群中，40%检测出中和抗体且稳定保持9个月，82%为无症状感染［12］。另有研究表明，SARS-CoV-2感染的轻症患者的抗体滴度下降速度较中度临床症状患者的抗体滴度下降更快，并在确诊感染5个月后免疫力下降［13-15］。

本研究表明，无症状者确诊病例抗SARS-CoV-2中和抗体及特异性IgG抗体总阳性率分别为66.67%和88.89%，有症状确诊病例分别为82.2%和90.1%。两种方法检测结果存在一定差异，可能是不同检测方法的特性不同造成的。表明对相同的样本，特异性IgG抗体较中和抗体检出敏感性更高。本研究无研究对象感染期间的血清样本，仅收集出院6个月后样本，因此，无法准确获得COVID-19患者6个月内抗体的动态变化情况。

至目前为止，我们对预防SARS-CoV-2的免疫相关性了解较少，这对受感染患者的长期随访及新型冠状病毒疫苗的临床研究均很重要，同时也无法评估COVID-19康复者再次暴露或再次感染的可能性。综上所述，用两种抗体检测方法均可在大多数确诊为有症状或无症状人群感染后6个月的体内检测到抗SARS-CoV-2抗体，表明SARS-CoV-2感染者体液免疫至少可持续6个月。

志谢国家重点研发计划2019-nCOV灭活疫苗2020YFC0-842100和湖北省重点研发计划2019-nCoV灭活疫苗关键技术研究KTSI1800083A提供经费支持