枸杞中绿原酸对转化生长因子-β1诱导心肌成纤维细胞纤维化的影响

牛丕莲，周学章，白明生

（宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021）

心肌纤维化主要表现为心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）的异常增殖和细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）的过度沉淀[1]，是多种心血管疾病发展至终末期的共同病理变化。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是最重要的促纤维化生长因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3亚型[2]。每一种亚型都有其独特的生物学功能，其中TGF-β1是主要的形式[3-4]。有研究表明，在心肌纤维化期间人体和动物模型中TGF-β1表达明显增加[4]。TGF-β1可以增强ECM的沉淀和CFs的转分化[5-6]，进而介导心肌纤维化发生的过程。参与心肌纤维化发生的信号通路有TGF-β1/Smads信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路和Wnt信号通路等，但TGF-β1/Smads信号通路被认为是心肌纤维化的主要途径[7]。

宁夏枸杞（Lycium barbarum）是茄科枸杞属，主要分布在宁夏、内蒙古、新疆等地，是药食两用食物，具有抗氧化、提高免疫力等生物活性[8]。酚类化合物是枸杞中主要的功能性成分之一，研究发现其可以抗氧化、治疗心血管疾病、预防癌症等[9-11]。绿原酸是宁夏枸杞的主要酚类提取物之一，研究发现绿原酸类具有抗癌、提高免疫力、抗菌等生物学活性[12-14]。但宁夏枸杞中绿原酸对心肌纤维化影响的研究目前鲜见报道。因此本实验通过用枸杞中分离得到的绿原酸干预TGF-β1建立的心肌纤维化细胞模型，考察枸杞中分离得到的绿原酸对TGF-β1诱导的小鼠CFs纤维化的影响，分析其在心肌纤维化病变过程中起到的作用，进而为宁夏枸杞中分离得到的绿原酸在心血管类疾病的临床治疗中提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁夏枸杞（Lycium barbarum）于2018年8月10日采自宁夏回族自治区中卫市中宁县大战场镇兴业村四队，经宁夏大学生命科学学院郑国琦教授进行了鉴定。

CFs于C57BL/6乳鼠出生后1～3 日的心脏组织中分离。

DMEM培养基 上海昱都生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒 宝日医生物技术（北京）有限公司；细胞毒性实验（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、胰蛋白酶 上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清 美国Gibco公司；Western blot技术相关的抗体赛信通（上海）生物试剂有限公司；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒北京丽科生物有限公司；台盼蓝 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

超低温冰箱 日本SANYO电器公司；电热恒温水浴锅 北京长源实验设备厂；电泳仪、细胞自动计数仪美国BIO-RAD公司；GE化学发光检测仪 美国Promega公司；电热恒温水浴锅 北京长源实验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 枸杞中绿原酸的提取分离

取干燥的宁夏枸杞果实5 kg粉碎，用体积分数80%乙醇浸提3次，合并提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取液减压浓缩干燥，得到乙酸乙酯萃取浸膏260 g，用二氯甲烷-甲醇（10∶0～0∶10，V/V）经正向硅胶柱层析进行洗脱，薄层色谱法检测合并相同洗脱部位，再经过MCI柱，半制备高效液相色谱和Sephadex LH-20柱进行纯化，得36 mg化合物，通过对绿原酸对照品薄层（V（乙酸乙酯）∶V（甲酸）∶V（蒸馏水）=14∶1∶1）展开检测及该化合物的波谱数据确定该化合物为绿原酸。

1.3.2 小鼠CFs培养

从新生1～3 d的C57BL/6乳鼠中取心尖部位，快速用含双抗的冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，切成1 mm的小块，在37 ℃下用0.25%（质量分数，下同）胰蛋白酶消化。消化后，离心（1 500 r/min、5 min）收集细胞，然后在有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM中培养，培养1.5 h后，弃去悬液。然后加入新鲜的DMEM培养基于培养皿中为已贴壁的CFs继续提供营养。培养24 h后，显微镜下持续观察细胞形态及贴壁状况，待细胞生长至85%左右时，进行后续所需实验。

1.3.3 心肌纤维化细胞模型建立

实验分为空白组（培养基、CCK-8）、对照组（未处理的细胞、培养基、CCK-8）和模型组（质量浓度10 ng/mL TGF-β1处理的细胞、培养基、CCK-8），细胞培养后调整浓度至1×105个/mL。将细胞悬液接种于96 孔板中，100 μL/孔，每个样本设置3个重复。培养12 h使其充分贴壁于96 孔板后，加入新鲜培养基并予以相对应的刺激处理，培养24、48 h。显微镜下观察拍照，记录细胞形态变化。弃去旧液加10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度，以吸光度表征细胞活力。

1.3.4 CCK-8检测枸杞中绿原酸对TGF-β1诱导的CFs增殖的抑制作用

取正常培养的CFs，调整浓度至1×105个/mL。实验分为空白组、对照组（未处理细胞）、模型组（质量浓度10 ng/mL TGF-β1处理）和绿原酸组（质量浓度10 ng/mL TGF-β1分别和不同质量浓度10、20、50 μg/mL绿原酸组合处理）。用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度，用于表征细胞活力。细胞活力越大，CFs增殖越快。

1.3.5 胶原蛋白I、III质量浓度的测定

CFs分组培养后，收集上清液至无菌离心管中，3 000 r/min离心20 min，收集上清液。设置空白孔、待测样品孔。按ELISA试剂盒说明书测定胶原蛋白（collagen，Col）I、Col III的质量浓度。

1.3.6 免疫荧光法测定α-平滑肌肌动蛋白的表达

将无菌玻片放入6 孔板中，调整CFs浓度为5×104个/mL，培养至细胞贴壁后，吸出旧液，用0.01 mol/L pH 7 PBS清洗，先用4%多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗后加100 μL 0.3% TritonX-100破膜处理20 min，PBS再清洗3次，5%牛血清白蛋白封闭20 min，弃上清液，加入α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗（V（抗体）∶V（抗体稀释液）=1∶500），4 ℃过夜，用PBS清洗，加荧光二抗，室温孵育，经PBS清洗后，取出玻片，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），倒置荧光显微镜下观察。

1.3.7 纤维化调节转录因子的mRNA表达量测定

通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测纤维化调节转录因子Snail1、Snail2、Twist1、Acta2、S100A4和Smad4的mRNA表达情况。CFs分组培养后，使用Trizol法提取CFs中总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA作为模板，进行逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增目的基因。选用GAPDH作为内参基因，对细胞中Snail1、Snail2、Twist1、Acta2、S100A4和Smad4进行相对定量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.8 Western blot检测TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达情况

利用全蛋白提取试剂盒中说明书的详细步骤进行总蛋白提取，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒进行蛋白质定量。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中经过上样-电泳-转膜的过程将蛋白转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用质量分数5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别用一抗Smad2/3、Smad4、P-Smad2、P-Smad3（每种抗体稀释比例为1∶2 000）4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗3次（10 min/次），并与相应的辣根过氧化物酶偶联二抗（V（二抗）∶V（TBST）=1∶5 000）在室温孵育2 h，TBST缓冲液彻底洗涤。发光液A、B等体积混合，用于蛋白显色，放入化学发光成像仪进行检测。

1.4 数据统计与分析

实验进行3次重复，采用GraphPad Prism 5软件中的One-Way ANOVA对数据进行显著性分析，使用GraphPad Prism 5软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 小鼠原代CFs分离培养形态学观察结果

显微镜下观察CFs生长状况，呈梭形或不规则多边形，排列较紧凑，胞质透明（图1）。细胞生长状态良好，符合CFs形态特征。

图1 小鼠CFs分离培养2、4 d显微镜下的照片Fig. 1 Microscope images of mouse CFs in vitro cultured for two and four days

2.2 心肌纤维化细胞模型形态学观察结果

TGF-β1（质量浓度10 ng/mL）诱导小鼠CFs，显微镜下观察细胞形态，结果显示诱导24 h后，与对照组相比，模型组CFs形态开始由梭形、不规则多边形变得狭长（图2A），诱导48 h后，模型组细胞完全变为狭长型（图2B），表明TGF-β1诱导小鼠CFs 48 h可使CFs细胞形态发生明显变化。

图2 TGF-β1诱导CFs建立的心肌纤维化细胞模型形态Fig. 2 Morphology of TGF-β1-induced CFs

2.3 枸杞中绿原酸对TGF-β1诱导的CFs增殖的影响

如图3所示，TGF-β1诱导48 h后，与对照组相比，CFs活力高度显著增加（P＜0.001），证实心肌纤维化细胞模型建立成功。不同质量浓度绿原酸作用后，与模型组相比，50 μg/mL绿原酸可高度显著抑制TGF-β诱导的细胞增殖（P＜0.001）。因此确定绿原酸质量浓度50 μg/mL、作用时间48 h用于后续实验。

图3 绿原酸对TGF-β1诱导的CFs增殖的影响Fig. 3 Effect of chlorogenic acid on the proliferation of CFs induced by TGF-β1

2.4 枸杞中绿原酸对CFs Col I、Col III蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组相比，TGF-β1诱导后，CFs Col I、Col III质量浓度高度显著增加（P＜0.001），经枸杞中分离得到的绿原酸干预后，Col I、Col III蛋白质量浓度均高度显著减少（P＜0.001）。

图4 绿原酸对TGF-β1诱导的CFs Col I、Col III蛋白表达的影响Fig. 4 Effect of chlorogenic acid on the expression of Col I and Col III in CFs treated with TGF-β1

2.5 枸杞中绿原酸对CFs α-SMA表达的影响

如图5所示，绿原酸组与模型组相比，α-SMA绿色荧光强度明显减弱。表明枸杞中分离得到的绿原酸对TGF-β1诱导的α-SMA表达有抑制作用。

图5 绿原酸对TGF-β1诱导的α-SMA蛋白表达的影响（400×）Fig. 5 Effect of chlorogenic acid on the expression of α-SMA in CFs induced by TGF-β1 (400 ×)

2.6 枸杞中绿原酸对TGF-β1诱导的CFs Acta2、Twist1、Smad4、Snail1、Snail2和S100A4 mRNA表达水平的影响

为考察枸杞中分离得到的绿原酸对TGF-β1诱导的CFs纤维化转录调控因子Acta2、Twist1、Smad4、Snail1、Snail2和纤维化蛋白S100A4的mRNA表达影响，进行了qPCR检测，结果如图6所示。与模型组相比，枸杞中分离得到的绿原酸干预后，细胞中Acta2、Snail1、Snail2、Smad4、Twist1和纤维化蛋白S100A4的mRNA表达水平均高度显著下调（P＜0.001）。

图6 绿原酸对TGF-β1诱导的CFs中Acta2、Twist1、Smad4、Snail1、Snail2和S100A4 mRNA表达影响Fig. 6 Effect of chlorogenic acid on the mRNA expression of Acta2,Twist1, Smad4, Snail1, Snail2 and S100A4 in CFs treated with TGF-β1

2.7 枸杞中绿原酸对TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达的影响

为探究枸杞中分离得到的绿原酸对TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达水平的影响，利用Western blot进行了检测，结果如图7所示。与模型组相比，枸杞中分离得到的绿原酸干预后，相关蛋白（Smad4、Smad2/3）及Smad2/3磷酸化水平表达均高度显著下调（P＜0.001）。

图7 绿原酸对TGF-β1诱导的TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达的影响Fig. 7 Effect of chlorogenic acid on TGF-β1/Smads signaling pathwayrelated protein and gene expression in CFs induced by TGF-β1

3 讨 论

心脏主要由心肌细胞和非心肌细胞组成，CFs约占非心肌细胞总量的70%。当心脏受伤时，心肌细胞大量坏死，CFs过度增殖，并分化成肌成纤维细胞，进而迁移和集中在心肌损伤区，产生Col I、Col III和α-SMA[15-17]，同时也会促进纤维化转录调控因子（如Snail1、Acta2、Twist1、Snail2等）的表达，最终导致心肌纤维化的发生。

TGF-β1/Smads信号通路是导致心肌纤维化发生的主要信号通路，Smad2和Smad3是促进TGF-β1介导的心肌纤维化的两个主要下游调控因子[18-19]。许小琪等[20]研究发现，丹参酮II A可以抑制TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞增殖，其机制可能与TGF-β1/Smads通路有关。Sun Xutao等[21]研究发现，芪苈强心可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路发挥抗纤维化作用。本研究用TGF-β1诱导CFs纤维化，用TGF-β1刺激CFs 48 h后，α-SMA表达明显增加，说明TGF-β1可以促进CFs纤维化的发生。同时也会促进纤维化转录调控因子mRNA（如Snail1、Acta2、Twist1、Snail2等）表达量和TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白及Smad2/3磷酸化水平增加，表明TGF-β1/Smads信号通路被激活。

宁夏枸杞是我国传统的中药材，具有滋补肝肾、益精明目的作用。现已被用于心脏病、月经不调、高血压和更年期等疾病的治疗[22-24]。张志涛等[25]研究发现，枸杞多糖通过调节大鼠肝纤维化微环境从而延缓肝脏纤维化；Gan Fang等[26]发现，枸杞多糖可以减轻CCl4诱导肝纤维化，其可能的作用机制与Toll样受体/核因子-κB（Toll-like receptors/nuclear factor，TLRs/NF-κB）信号通路有关。宁夏枸杞中含有多种酚酸类化合物，绿原酸是其主要活性成分之一，Qin Linhui等[27]研究发现，用链唑霉素诱导小鼠患1型糖尿病，经绿原酸治疗12周后，绿原酸除了降低血糖外，还抑制了心脏纤维化；Yang Fan等[28]研究发现，绿原酸可通过调节TGF-β1/Smad7信号通路减轻肝纤维化；Wang Yichun等[29]通过博来霉素诱导小鼠肺纤维化，然后用绿原酸进行治疗，发现绿原酸可通过体内外抑制内质网应激来抑制肺纤维化。

本研究采用一定质量浓度的从宁夏枸杞中分离得到的绿原酸干预TGF-β1诱导的CFs，与单纯用相同浓度TGF-β1诱导CFs相比发现，在一定质量浓度范围内从宁夏枸杞中分离得到的绿原酸可按剂量依赖方式抑制TGF-β1诱导的CFs的增殖和Col I、Col III和α-SMA的表达，同时也抑制纤维化转录调控因子（如Snail1、Acta2、Twist1、Snail2等）mRNA的表达，因此绿原酸可以抑制CFs的纤维化。该研究还发现，用一定质量浓度绿原酸干预TGF-β1诱导的CFs后，与TGF-β1/Smads信号通路相关的蛋白Smad2/3、Smad4等的表达也受到抑制，表明枸杞中绿原酸抑制CFs纤维化的机制可能与TGF-β1/Smads信号通路有关。

本研究表明，从宁夏枸杞中分离得到的绿原酸可以抑制CFs纤维化进程，其作用机制可能与TGF-β1/Smads信号通路有关。这一发现为宁夏枸杞中分离得到的绿原酸在临床预防治疗心血管疾病的进展中提供有力的实验证据。