食源性抗炎活性肽对肠道炎症的作用研究进展

沈圆圆，于福田，赵笑颍，刘小玲

（广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）

炎症是人体对有害刺激（例如物理创伤、化学暴露以及细菌或病毒感染）的一种复杂且高度调节的防御反应。炎症通常会因组织肿胀或水肿而加剧，渗出液到达损伤部位，会导致严重的组织损伤。炎症与细胞因子密切相关，涉及多种促炎细胞因子的表达。长期的炎症与一些健康问题有关，炎症几乎影响所有主要疾病和次要疾病，克服炎症将是一项关乎全世界人类健康的巨大挑战。

肠道炎症属于慢性炎症，例如炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种与肠道慢性炎症相关的特发性疾病。IBD主要有两种类型：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn’s disease，CD）。IBD各年龄段都可发病，但青壮年为高发人群，男女发病人数比例基本没有差异[1]。自21世纪初以来，IBD被认为是西方国家发病率加速上升的肠道疾病之一。流行病学研究表明，目前IBD全球患病率超过0.3%，西方国家IBD的发病率趋于稳定或开始下降，而亚洲、中东、非洲和南美洲等新工业化国家的发病率正在迅速上升[2]。IBD病发原因目前尚不清楚，可能与自身免疫调节紊乱、肠黏膜屏障受损、肠道菌群分布改变、遗传学、环境、饮食及精神因素等相关[3]。IBD无法完全治愈，需要复杂的终生治疗来预防或延缓病情发展。人类对这些疾病的发病机理知之甚少，患有这些疾病的患者遭受精神压力和身体疼痛，给他们的家庭带来沉重的经济负担以及造成社会巨大的经济损失[4]。然而，常用于治疗IBD的抗炎药物不仅成本高，还具有很高的副作用，也会产生耐药性等问题。目前，迫切需要寻找成本低、更安全和有效的抗炎药物来克服这种状况，因此近几年的研究多集中在新药研发上。

生物活性肽通常由2～20个氨基酸残基组成，能够发挥超出其亲本蛋白质营养价值的有益生物活性[5]。生物活性肽可通过酶促水解、发酵或胃肠道消化获得。相比于蛋白质和游离氨基酸，生物活性肽在机体的吸收方面具更突出的优势，尤其是二肽和三肽，可完整地被肠上皮细胞吸收。在胃肠道中，食物蛋白需要酶解成游离氨基酸或小肽才能被人体吸利用。氨基酸的吸收过程耗能高，载体易饱和，吸收速度慢。小肽吸收过程虽然也是一个耗能过程，但其耗能低，载体不易饱和，吸收速度更快。超过10个氨基酸的生物活性肽通常通过非载体介导的细胞转运被肠上皮细胞吸收，并且涉及与细胞膜脂质双层的疏水相互作用[6]。生物活性肽可通过肠上皮细胞吸收而释放到循环血液中，从而使其到达靶器官或系统发挥作用，也可以在胃肠道中产生局部效应。另外，被吸收的生物活性肽在进入血液循环之前被运输到肝脏进行代谢[7]。生物活性肽由于具有公认的安全性高、成本低和易吸收等多种健康益处，因此是开发功能性食品和营养保健品的有前途的成分。生物活性肽已被证实具有抗癌、降血压、降胆固醇、降血糖、抗氧化、免疫调节和抗菌等多种生理功能，其他功能活性也逐渐被开发，生物活性肽已成为药物、功能性食品和其他领域的研究热点。近年来，生物活性肽的抗炎活性也受到越来越多国内外研究学者的关注，因此利用生物活性肽预防和补充IBD治疗具有重要意义。本文就肠道炎症治疗现状，对目前国内外食源性抗炎活性肽的来源、制备、分离纯化、鉴定、抗炎活性评价及作用机制进行综述，并探讨食源性抗炎活性肽的应用现状，以期为深入研究及开发抗炎药物及肠道健康功能性食品提供参考。

1 肠道炎症的治疗进展

肠道炎症是免疫系统对伤害或疾病的自然反应，炎症反应产生的多种细胞因子和炎性介质会引起组织和肠上皮细胞损伤、肠黏膜屏障功能受损、肠黏膜通透性增加，为致病菌的移位、过度繁殖和转运创造有利条件，最终导致肠道菌群失衡[8]。过度的肠道炎症会诱发肠癌，因此减轻肠道炎症和恢复肠道健康至关重要[8]。IBD是一种慢性复发性和缓解性肠道炎症疾病，其特征为肠道炎症、组织损伤、腹痛、体质量减轻、直肠出血和疲劳等。

目前IBD国内外主要的治疗药物及治疗方式包括：氨基水杨酸制剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、生物制剂、外科手术、粪便菌群移植、间充质干细胞移植、营养支持等[9-10]。5-氨基水杨酸酯是IBD治疗中局部作用的药物，口服给药每天大于6 g时，会造成全身性不良反应，例如肝脏损害发生率增大[11]。皮质类固醇可以有效诱导缓解IBD，但不良副作用使其无法长期使用[12]。免疫因素也是引发IBD的因素之一，免疫抑制剂可用于难治性IBD且安全性较高，但也存在起效较慢等现象[13]。现已有几种针对IBD病理的特定生物学因子的生物制剂，主要包括抗肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、抗黏附分子、抗白细胞介素（interleukin，IL）-12等[14]，但也存在部分患者对该疗法无反应的现象[15-16]。药物治疗效果不佳的患者往往需要进行手术治疗，外科手术后也会出现感染、脓肿、肠梗阻、吻合口漏或任何需要再次手术等并发症[17]。粪便菌群移植是一种直接改变受体肠道菌群以使组成正常化并获得治疗益处的方法。在临床实践中使用粪便菌群移植也存在一定的局限性，包括寻找合适的供体不易，制备新鲜的粪便样品艰巨且耗时，并且缺乏标准化的治疗方案[18]。间充质干细胞具有强大的免疫调节功能，可缓解炎症和修复组织功能[19]；不过间充质干细胞移植疗法的细胞来源、剂量和给药间隔、分离、培养和扩增方案仍有待确定，造成研究之间存在差异难以合理化[20]。

虽然IBD治疗药物及方法多种多样，但反复更换治疗方案疗效不佳，并且存在患者用药依从性差、疾病复发率高、大多数患者无力负担终身使用药物费用等问题，使得医疗行业乃至社会面临巨大的压力与挑战[21]。

2 食源性抗炎活性肽的来源

当前蛋白质是炎症性肠病防御和治疗的研究热点，这主要是由于蛋白质除了提供基本营养外，还具有生理健康益处。蛋白质对维持人体的营养健康功能至关重要，不仅是氨基酸的主要来源，同时也是生物活性肽的主要来源。生物活性肽因其结构特征，使它们能够与生物配体相互作用，并赋予其基本营养以外的功能。生物活性肽具有多种活性，例如抗氧化、抑菌性、降血压等都有了一定的研究，近年来关于其抗炎活性的研究也越来越多。

生物活性肽来源广泛，各种各样的食物蛋白已被用于提取生物活性肽。目前，从动物、植物及海洋生物中分离出多种具有抗炎活性的食源性生物活性肽；其中动物源抗炎活性肽的来源蛋白有鹿茸蛋白、昆虫蛋白、乳清蛋白、鲟鱼蛋白等[22]；植物源抗炎活性肽的来源蛋白有玉米蛋白、小米谷醇溶蛋白、油菜籽蛋白、榛子蛋白等[23-25]；海洋源抗炎活性肽的来源蛋白有极大螺旋藻、鲱鱼、蟹腿肌肉等[26]。Zhao Lei等从鹿茸蛋白的模拟胃肠消化（胃蛋白酶-胰酶水解物）中鉴定出4种抗炎活性肽，分别为VH（Val-His）、LAN（Leu-Ala-Asn）、AL（Ala-Leu）和IA（Ile-Ala）[27]。Zielińska等对食用昆虫的生物活性肽进行了鉴定和化学合成，发现合成肽能够有效抑制脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）和环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）活性，有效缓解炎症[28]。Aguilar-Toala等从特定植物乳杆菌菌株的发酵乳中获得的粗提物和肽组分（分子质量＜3 kDa和3～10 kDa）能够抑制热诱导蛋白质变性，粗提物和肽组分（分子质量＜3 kDa和3～10 kDa）显示出较高的抗炎活性[29]。海洋生物占全球生物总量的一半左右，海洋生物资源已成为药物和营养保健应用中新型化合物的重要来源[30]。Durand等从鲱鱼鱼肉水解物中鉴定出两个新的阳离子肽序列（IVPAS和FDKPVSPLL），并证明了其体外抗炎活性[31]。Narayanasamy等通过使用胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解蟹腿肌肉，最终分离得到的肽具有抗炎活性[26]。

关于食源性抗炎活性肽的研究主要集中在从动物、植物、海洋生物身上提取活性物质，尤其以乳蛋白、大豆蛋白和鱼蛋白等物质中分离得到抗炎活性肽的研究较多，对微生物源抗炎活性肽的研究相对较少。另外，随着工业化的不断发展，随之而来产生了大量废弃物或副产物，其中含有丰富的蛋白质资源被用作肥料、饲料或丢弃。为了生物资源的开发利用和可持续发展，加工副产物或废弃物受到广泛关注，其在生产抗炎活性肽方面具有巨大潜力。近年来，酒糟、母鸡、鲱鱼副产物、菜籽、极大螺旋藻和玉米面筋都已用于生产食源性抗炎活性肽，这些应用可以提高企业的经济效益和资源的综合利用率。

3 食源性抗炎活性肽的制备方法

生物活性肽常用的制备方法有：酶解法、微生物发酵法、化学合成法、基因重组法、生物提取法和化学水解法。关于食源性抗炎活性肽制备方法的选择，需根据肽的种类、综合各方面因素，选择性价比较高的制备方法。在目前研究和实际应用中，食源性抗炎活性肽主要通过酶解法、微生物发酵法和化学合成法制得。

3.1 酶解法

目前，酶解法是制备食源性抗炎活性肽最主要的方法。与微生物发酵法相比，酶水解的过程通常更快并且更易于控制。与化学合成法相比，酶解法制得的抗炎活性肽特异性更高，无有机溶剂或有毒化学物质的残留，已成为食品和制药工业中生产抗炎活性肽的优选方法。酶的特异性、酶解时间、酶解温度、酶/底物比和水解度等条件对肽的功能活性都有影响[32]。据文献报道，用于制备食物蛋白水解产物的优选商业酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味酶等。Ge Huifang等用碱性蛋白酶在pH 10.0、56 ℃条件下酶解变性蛋清3 h，所得蛋清肽的抗炎活性在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的结肠炎模型中得到验证[33]。由于酶具有专一性、酶切位点有限等特点，单一酶酶解制备生物活性肽的效果有时不佳，通常需要选择适当的复合酶进行酶解。Narayanasamy等用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对蟹腿肌肉进行酶解，水解度的结果表明，这些酶能有效地催化蛋白质水解[26]。在一些研究还通过体外模拟胃肠消化的方法从食物蛋白质中产生出抗炎活性肽，试图确定在食用特定食物或食物蛋白质后，人体内可能产生的肽的活性。Zhang Mengya等对皮蛋蛋白模拟胃肠道消化，所获得的4种消化肽在TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型中表现出抗炎活性[34]。

3.2 微生物发酵法

可利用微生物生长过程中分泌的蛋白酶降解食物蛋白而制备抗炎活性肽。酶解程度取决于蛋白质来源、菌种、发酵温度、发酵时间和pH值等条件[35]。据文献报道，细菌、酵母和内生真菌等微生物已被用于食源性抗炎活性肽的制备。Luti等用乳酸杆菌和酵母菌发酵面粉，在发酵的酸面团中分离得到的低分子质量肽在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导RAW264.7细胞炎症模型中表现出抗炎活性[36]。Li Feng等用刺盘孢属植物内生真菌S8发酵大米，分离纯化并鉴定出4种具有体外抗炎活性的环状三肽[37]。与酶解法相比，微生物发酵制备抗炎活性肽的方法更加简便而且成本低。然而，由于微生物发酵法产生肽的得率低、特异性不强、质量不稳定等特点阻碍了微生物发酵法在抗炎活性肽工业生产中的应用。

3.3 化学合成法

食源性抗炎活性肽都可以通过化学合成的方法获得。食源性抗炎活性肽制备和研究的经典方法是先寻找合适的食物蛋白质来源，然后利用蛋白酶或微生物发酵对其水解，然后对水解产物进行分离纯化和鉴定以确定目标活性肽的序列，对鉴定的肽进行化学合成，并进一步评估其抗炎活性。例如，Tenore等利用固相合成法来合成来源于水牛乳的多肽，研究其在IBD治疗中的作用[38]。Ren Dayong等发现榛子蛋白酶水解物具有抗氧化和免疫调节活性，分离纯化并鉴定出最佳免疫调节肽（LDAPGHR），通过化学合成法来合成LDAPGHR，对其功能活性近一步研究，发现其在LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型中表现出抗炎活性[25]。与酶解法和微生物发酵法相比，化学合成法的副产物更多、肽易降解、成本高，所以在实际应用中受到了限制[39]。常用的生物活性肽制备方法整理见表1。

表1 常用的生物活性肽制备方法Table 1 Common preparation methods for bioactive peptides

4 食源性抗炎活性肽的分离纯化和鉴定

通过酶解法、微生物发酵法和生物提取法等制备方法得到的粗提物中含有蛋白质、脂类、糖类、氨基酸、核酸和无机盐等物质，为获得高活性、高纯度、高得率的生物活性肽，还需对粗物进行分离纯化。如表2所示，目前食源性抗炎活性肽一般通过沉淀法、膜分离技术、离子交换层析（ion-exchange chromatography，IEC）、疏水层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、凝胶过滤层析（gel filtration chromatography，GFC）、反相高效液相色谱法（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）进行逐级分离纯化。沉淀法包括有机溶剂沉淀法、选择性变性沉淀法、等电点沉淀法和盐析法等方法。有机溶剂沉淀法常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇和氯仿等，其中乙醇在工业中应用最广泛。盐析法可用于从批量回收到选择性分离的所有纯化阶段，通常用硫酸铵、氯化钠或硫化钠等无机盐进行盐析，其中硫酸铵应用最广泛[43]。膜分离技术根据截留分子质量的不同分为微滤、超滤（ultrafiltration，UF）、纳滤和反渗透，其中UF的截留分子质量范围在1～300 kDa，被广泛用于抗炎活性肽的分离纯化。离子交换色谱是抗炎活性肽最常用技术之一，通常与GFC联用。GFC也称为分子筛色谱法或尺寸排阻法，该技术的分离效果主要受包括填料类型、色谱柱体积或流速等因素的影响。目前对食源性抗炎活性肽的分离纯化以交联葡聚糖凝胶（Sephadex）应用最广，常用型号为G-15和G-25。在RP-HPLC中，常用的固定相为十八烷基键合硅胶，常用的流动相为超纯水、甲醇和乙腈。据报道，通过用超滤膜将极大螺旋藻的酶水解物分离成不同的分子质量，其截留分子质量为10、5、3 kD；所得级分通过Superdex peptide 10/300 GL凝胶色谱柱进一步纯化；之后采用配有C18色谱柱的RP-HPLC仪纯化得到两种抗炎活性肽：LDAVNR和MMLDF[44]。不同的技术具有各自的优点和缺点，仅通过使用单一技术难以获得理想的肽组分，因此多种分离技术的结合可以实现肽混合物的准确分类和分离，从而获得高纯度的抗炎活性肽。

表2 食源性抗炎活性肽主要分离纯化方法Table 2 Major separation and purification methods for food-derived anti-inflammatory peptides

经过一系列分离和纯化后，还需对肽的结构进行鉴定。肽鉴定的常用方法包括电泳法、埃德曼降解法、DNA顺序分析法、红外/紫外光谱法、核磁共振和质谱法。生物活性肽的功能活性氨基酸组成随着质谱分析技术在生物领域的发展和应用，快原子轰击质谱法（fastatom-bombardment mass spectrometry，FAB-MS）、电喷雾电离质谱（electrospray ionization，ESI-MS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）、超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS/MS）和液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法已逐渐成为鉴定蛋白质及生物活性肽的常用方法[47]。目前食源性抗炎活性肽的分离纯化及结构序列分析是将多种分离鉴定方法联合使用，充分利用色谱的强分离性能与质谱的强定性优势，便可获得生物活性肽的结构信息，从而鉴定食源性抗炎活性肽的可能结构。Ma Ye等用碱性蛋白酶水解乳清蛋白研究其潜在抗炎活性肽，并用UPLC/Q-TOF-MS/MS对其氨基酸序列进行分析鉴定，获得了8种具有抗炎潜力的肽，其中包括2种新肽：DYKKY和DQWL[48]。Durand等用超滤膜电渗析分离鲱鱼水解产物收集到4个级分：两个阴离子级分和两个阳离子级分；通过混合离子淌度四极杆飞行时间质谱仪从两个阳离子回收级分中鉴定出两种抗炎活性肽（IVPAS和FDKPVSPLL）[31]。

5 食源性抗炎活性肽抗炎活性评价

抗炎活性评价方法有两种：一种是通过建立细胞炎症模型进行体外活性评价；另一种是通过建立动物炎症模型进行体内活性评价。

5.1 体外抗炎活性评价

在各类活性物质筛选、验证和作用机制研究中，细胞炎症模型因其快速、灵敏、成本低和易操作等优势，已成为体外活性评价的重要工具。体外抗炎活性评价方法主要是对相应的细胞进行培养，然后建立炎症模型，再通过细胞活性、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、实时荧光定量聚合酶链式反应和Western blotting来检测抗炎活性肽对细胞模型中相关炎症因子在基因水平和蛋白水平的表达以及含量的影响[49]。如表3所示，在生物活性肽的抗炎活性研究中，可通过使用TNF-α、H2O2或LPS刺激诱导Caco-2细胞、HT-29细胞和RAW264.7巨噬细胞等构建细胞炎症模型[34]。常见的Caco-2细胞系源自人结肠腺癌细胞，与小肠上皮细胞的结构和功能类似，是适合肠道炎症相关研究的体外模型，外源性刺激物TNF-α诱导Caco-2细胞产生的炎症反应在很大程度上由趋化因子IL-6和IL-8介导。Zhang Mengya等选择IL-8作为炎症标志物，测定了皮蛋清模拟胃肠道消化肽在TNF-α诱导的Caco-2细胞模型中的抗炎作用[34]。在炎症发生的过程中，巨噬细胞具有3个主要功能：抗原呈递、吞噬和通过产生各种细胞因子和生长因子进行免疫调节。巨噬细胞在炎症的发生、维持和消除中起着关键作用，是调控炎症反应的中心细胞。Hao Yuqiong等从脱脂大豆中分离得到的Lunasin肽在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中显示出很高的抗炎活性，并显著抑制了炎症细胞因子的产生[50]。Chen Yuhuan等从豆浆和酸奶中分离得到分子质量小于10 kDa的肽在TNF-α诱导的Caco-2细胞和HT-29细胞炎症模型中有效抑制炎症细胞因子IL-8分泌[51]。

表3 食源性抗炎活性肽的体外活性评价Table 3 Recent studies on in vitro activity evaluation of food-derived anti-inflammatory peptides

5.2 体内抗炎活性评价

与细胞模型相比，动物模型具有重复性、可靠性和稳定性等优点，可以更加科学、准确地探究IBD的病因、病理、治疗机制，并对抗炎药物的开发和临床研究具有重要意义[63-64]。通常，理想的动物模型应显示某些关键特征，例如肠道应表现出形态学改变、炎症症状和体征，以及与人体IBD相似或相同的病程。动物模型多种多样，如基因工程类动物模型、化学药物诱导模型、细胞移植类IBD模型、细菌诱导类模型和自发类动物模型，其中化学药物诱导模型简单易行，所以成为构建肠道炎症的主要方法。化学药物诱导模型主要包括DSS诱导结肠炎模型、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenze sulfonic acid，TNBS）诱导结肠炎模型、恶唑酮诱导结肠炎模型和乙酸诱导结肠炎模型，在抗炎活性肽研究中主要应用以下两种模型。

5.2.1 葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎模型

DSS作为一种由蔗糖合成的硫酸多聚体，有抗止血抗凝血作用。DSS主要通过增加肠道黏膜通透性，上调某些炎症因子，引起肠道微生物菌群失衡而引发炎症。这种模型操作简便，只需给实验动物自由饮用一定浓度的DSS即可，最重要的是该模型的组织学特点，例如远端结肠受累更严重、黏液流失、通透性增加、中性粒细胞浸润、隐窝脓肿和浅表黏膜糜烂等特点与人体的UC十分相似，并且方法简单、结果重现性好，因此被广泛使用。王晓丽通过构建DSS结肠炎模型，研究发现生物活性肽Y7和S6可以改善结肠炎小鼠体质量下降和临床评分情况，表现出明显的抗炎作用[65]。Lee等[66]采用DSS结肠炎模型研究蛋清肽的抗炎活性。连续5 d经胃内导管给予DSS诱导结肠炎，然后用蛋白肽或生理盐水治疗5 d。结果发现蛋白肽可减轻DSS引起的临床症状，包括体质量减轻、肠黏膜炎症、隐窝变形和结肠肌增厚，并通过降低肠道通透性和增加黏蛋白基因表达来恢复肠道屏障功能[66]。

5.2.2 2,4,6-三硝基苯磺酸诱导结肠炎模型

TNBS是一种半抗原物质，可溶解肠黏膜表面黏液，破坏肠黏膜屏障，造成黏膜损伤，从而诱发肠道炎症。该模型同样具有易操作、重复性好和成本低等特点，但也存在一定的局限性，就是缺乏急性期表现，动物死亡率较高。因此，控制好药物的剂量十分关键[67]。Yin Bingjiao等用TNF-α结合环肽和肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）1结合环肽联合治疗TNBS诱导的大鼠结肠炎1周后，发现此组合有效地改善了TNBS诱导的结肠炎症状并减轻了大鼠的结肠炎组织病理学损伤[68]。Abad等通过构建TNBS结肠炎模型，发现血管活性肠肽可减轻TNBS引起的结肠炎的临床和组织病理学严重程度，改善体质量减轻、腹泻以及肠道炎症[69]。

食源性抗炎活性肽的体内活性评价整理见表4。近年来IBD的模型越来越复杂多样，研究人员可以针对性地使用动物模型来解决特定的问题。尽管没有单一的动物模型能够完全反映人类IBD的所有临床特征和病理特征，但是每种动物模型都有助于我们更好地理解慢性肠道炎症的发生过程和持久性机制。

在IBD的动物模型中，若将体质量变化和便血程度作为肠道炎症病情检测指标不足以客观、真实地反映疾病严重程度，还需通过疾病部位组织学、病理学、基因水平和蛋白水平等方面来对病情程度做出更加确切的判断，从而为药物评价提供依据。例如还可通过聚合酶链式反应扩增来对比炎症因子的基因含量，从基因水平评价肠道的炎症[47-48]。对炎症因子进行实时荧光定量检测，研究目标活性肽对其表达量的影响，从而对目标活性肽的抗炎作用机理进行初步探究[83]。

表4 食源性抗炎活性肽的体内活性评价Table 4 Recent studies on in vivo activity evaluation of food-derived anti-inflammatory peptides

6 食源性抗炎活性肽作用机制

食源性抗炎活性肽主要通过调节炎症细胞因子的释放、氧化应激反应、炎症相关信号通路及其转录因子的表达，以及调控肠道免疫及上皮屏障功能等作用机制来发挥作用。

6.1 调节炎症细胞因子的释放

许多促炎或抗炎细胞因子在肠道炎症中发挥关键作用，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-12[83]等。TNF-α、IL-1β和IL-8通过协同诱导其他细胞因子、趋化因子和黏附分子的产生来加剧炎症反应。如IL-6与其受体结合后参与抗凋亡基因的表达，从而防止T细胞凋亡，活化T细胞不受控制的增殖最终加剧了炎症反应。这些促炎细胞因子的mRNA表达在炎症反应中似乎被上调。然而，IL-10作为抗炎细胞因子，可以抑制促炎细胞因子的合成，从而调节炎症反应[84]。抗炎活性肽通过调节细胞因子的释放，即抑制促炎细胞因子合成或者上调抗炎细胞因子表达，从而减轻炎症细胞因子诱导的炎症。Gao Ruichang等研究发现鲟鱼蛋白衍生的3种肽在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中可有效抑制炎症细胞因子IL-1β和IL-6的释放[22]。Ji Zhongwei等研究发现小米谷醇溶蛋白肽通过抑制经LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞产生炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，能够显著减轻炎症反应[24]。Zhang Mengya等分离并鉴定了源自皮蛋白（SGD-PEW）的6种肽，其中DEDTQAMPFR（DR-10）、DEDTQAMPF（DF-9）、MLGATSL（ML-7）和MSYSAGF（MF-7）显著抑制IL-8分泌，并显著降低TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IL-12基因的表达，促进IL-10基因的表达[34]。

6.2 调节氧化应激反应

抗炎活性肽通过抑制iNOS和COX-2的表达来减轻氧化应激反应，从而调节炎症反应[49]。一氧化氮（NO）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的过量产生与iNOS和COX-2的过度表达有关[85]。iNOS和COX-2是炎症过程中的关键酶，也是NO和PGE2合成的上游酶。例如正常情况下，巨噬细胞很少表达iNOS；但当LPS诱导巨噬细胞后，iNOS将大量表达并释放NO，从而导致炎症性疾病和细胞损伤。NO参与细胞间和细胞内信号传递，以及免疫和炎症过程中作为介导。免疫激活的巨噬细胞在炎症部位分泌NO进行组织修复以消除炎症，但是过量的NO会导致各种炎症性疾病。因此，抑制NO的产生是治疗炎症性疾病的另一种途径[86]。Ahn等从鲑鱼副产物蛋白中分离出的三肽（PAY），PAY处理对NO和PGE2的抑制率分别为63.80%和45.33%[84]。蛋白质印迹分析表明，PAY显著抑制了iNOS和COX-2的蛋白表达[84]。Ding Ni等研究皮蛋对RAW264.7巨噬细胞的抗炎活性，并比较了皮蛋、皮蛋清和皮蛋黄的不同抗炎作用，发现它们能显著抑制RAW264.7巨噬细胞中NO、TNF-α和IL-6的分泌，且没有明显的细胞毒性，并抑制COX-2和iNOS基因的表达[87]。Lee等[88]评估了从条斑紫菜中提取的生物活性肽（PPY1）在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的体外抗炎机制。PPY1对LPS刺激的巨噬细胞释放促炎性细胞因子（iNOS、COX-2、IL-1β和TNF-α）具有剂量依赖性抑制作用[89]。

6.3 调控炎症相关信号通路及其转录因子的表达

细胞因子对炎症的影响最终还需通过胞内外信号转导途径完成。目前研究表明抗炎活性肽抑制细胞炎性反应主要与MAPK和NF-κB通路有关。MAPK和NF-κB通路是负责调节促炎性细胞因子和介质如IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2转录的最重要的两个途径，抗炎活性肽调节作用归因于其通过阻断NF-κB和MAPK信号传导途径抑制炎性基因表达。

MAPK途径在将细胞外信号转导到许多生物过程中起重要作用，包括炎症、凋亡、细胞分化和增殖。MAPKs为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，包括p38、胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和Jun激酶（Jun kinase，JNK）亚族。研究表明，MAPKs的激活是LPS诱导巨噬细胞信号转导的一个标志。当LPS通过与细胞膜上toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR-4）结合而刺激时，MAPKs（p38、ERK和JNK）被磷酸化，随后其下游信号通路被激活，这与在LPS诱导的巨噬细胞中的NF-κB产生炎症介质有关。MAPK途径在炎症阶段中控制iNOS和COX-2表达中具有不同的作用[89]。

NF-κB在炎性疾病如IBD和结肠癌中起着至关重要的作用。NF-κB家族在哺乳动物中有5种蛋白，分别是NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB和c-Rel。在NF-κB经典通路中，静息状态下NF-κB二聚体与NF-κB抑制蛋白（inhibitor-κ binding protein，IκB）α以失活状态存在于细胞质中。在受到包括LPS和炎性介质的刺激后，IκBα发生磷酸化和降解，导致NF-κB p65的释放。NF-κB信号通过IκBα的磷酸化迅速激活，然后NF-κB p65亚基易位到细胞核中，启动靶基因的转录并诱导促炎症介质的表达。因此，抑制NF-κB的活化被认为是调节多种炎症介质产生的重要靶标之一[90]。

Wang Xiong等利用TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症模型，通过体外模拟肽切割来评估卵转铁蛋白及其二肽的抗炎作用。在基于模拟肽切割的OVT衍生的18种二肽中，CR、FL、HC、LL和MK明显抑制了IL-8的分泌。此外，这5种二肽均能显著抑制Caco-2细胞中炎症细胞因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IL-12的基因表达，而对抗炎细胞因子IL-10的基因表达起促进作用。FL、LL和MK通过调节NF-κB信号通路来减弱细胞炎症反应，从而降低促炎细胞因子的转录和表达。此外，CR和HC抑制了JNK和p38的磷酸化，阻断MAPK和NF-κB信号通路发挥的抗炎活性[91]。

6.4 调控肠道免疫及上皮屏障功能

肠道除了日常进行消化吸收的功能之外，还具有肠道免疫功能。肠道是人体最大的免疫器官，肠道免疫占全身免疫功能的70%。肠黏膜屏障作为人体的第一道防线，在免疫防御中起重要作用。肠上皮屏障作为肠黏膜屏障的重要防线之一，肠上皮屏障功能在肠道炎症中受损会导致肠上皮通透性增加，参与IBD的发病过程。近年来研究发现，食源性抗炎活性肽主要通过修复上皮细胞及细胞间紧密连接而改善肠上皮屏障功能[92]，从而在IBD中发挥作用。Lee等用不可代谢的糖醇D-甘露醇评估蛋清肽对胃肠道通透性的影响，研究发现蛋清肽能够修复DSS诱导的肠上皮屏障损伤[66]。Ge Huifang等用DSS诱导的肠上皮屏障损伤研究蛋清肽的抗炎活性，为了确定结肠黏膜糜烂和溃疡的程度，使用典型的苏木精-伊红染色研究结肠的组织病理学变化，结果发现，蛋清肽治疗可增强肠道免疫应答，减少炎性细胞数量，减轻隐窝损伤，修复肠上皮细胞[33]。

7 食源性抗炎活性肽应用现状

尽管生物活性肽的研究正在蓬勃发展，尤其是具有抗炎活性的生物活性肽，但是将这些新发现转化为诸如保健食品、功能食品、药品之类的商业产品仍然滞后。目前，国内外仅有几种针对皮肤炎症的抗炎活性肽产品上市。例如，国内某护肤产品祛痘净颜精华液中添加了植物来源的抗炎活性肽（棕榈酰三肽-8），针对痤疮痘肌，通过抑制炎症因子释放达到镇定褪红和舒缓的效果；国外某护肤产品抗炎活性肽乳液中添加了来源于谷胱甘肽的S-乙酰基谷胱甘肽以及L-五肽，该产品专治慢性炎症性皮肤病痤疮，具有减轻组织炎症和改善表皮屏障功能的功效。上述相关上市的食源性抗炎活性肽产品主要针对皮肤炎症发挥作用，而针对肠道炎症的食源性抗炎活性肽产品几乎没有。另外，绝大部分的上市抗炎活性肽为外用型产品，目前鲜有相关内服型产品上市。造成这一现状的原因，主要是由于目前食源性抗炎活性肽的研究仍处于实验室研究阶段，缺乏完整的临床实验数据为食源性生物活性肽潜在的抗炎活性提供实质性证据。

8 结 语

随着IBD发病率逐年上升，促使人们对基于天然、安全的替代药物或补充疗法进行研究，关于食源性生物活性肽抗炎活性方面的研究不断深入，从越来越多的食物资源中分离出新型且活性较高的抗炎活性肽，其在抗炎活性药物、肠道健康功能性食品等方面的应用具有很大的发展潜力。现阶段国内外研究多采用酶解法制备食源性抗炎活性肽；使用UF、IEC、GFC和RP-HPLC等技术分离纯化得到食源性抗炎活性肽；通过液相色谱与质谱联用技术对抗炎活性肽的氨基酸序列进行分析鉴定。但是该策略也存在步骤繁琐、耗时和成本高等问题，而且得到高纯度的抗炎活性肽较为困难，所以还需创建更加快速便捷的抗炎活性肽筛选方法。目前对食源性抗炎活性肽的研究仍处于实验室阶段，难以批量生产，生产的活性肽分离设备需要进一步改进，使得食源性抗炎活性肽能够大批量生产。

目前，虽然已从食物蛋白质中鉴定出大量的抗炎活性肽，但对食源性抗炎活性肽构效关系的研究比较有限，因此很难确定其生物活性的特定结构特征，还需要进一步研究其分子机制。关于食源性抗炎活性肽胃肠道消化、吸收和转运机制还需详尽地阐明，因为有研究表明食源性抗炎活性肽不一定需要从胃肠道吸收才能发挥生物活性[35]。胃肠道本身是一个很大的器官，食源性抗炎活性肽的局部作用是一个日益受到关注的领域。食源性抗炎活性肽通过体内和体外活性评价，证明其对IBD患者改变肠道内环境具有一定的作用，它们通过几种机制发挥抗炎活性、增强或修复胃肠道稳态等健康作用。但是，涉及人类受试者的临床研究较少。因为食源性抗炎活性肽在人体内的作用效果、最佳给药方式、给药剂量、稳定性、安全性等问题尚不明确，所以食源性抗炎活性肽的相关产品暂未上市，未来应将食源性抗炎活性肽由实验室水平研究向商业化产品转变。另外，相信随着研究的不断深入，食源性抗炎活性肽对肠道炎症的作用机制也会越来越明确。