基于GAPDH重组蛋白建立羊肝片吸虫病间接ELISA检测方法

孙益春 ， 魏雅婷 ， 郑芦珊 ， 杨 莹 ， 张金鹏 ， 庞紫璇 ， 路义鑫

(东北农业大学动物医学学院 黑龙江省动物源性人兽共患病重点实验室 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

肝片吸虫病是由肝片吸虫(Fasciolahepatica)寄生于人和牛、羊等肝脏、胆管，引起肝炎、胆管炎以及全身性营养障碍的一种寄生虫病。该病呈世界流行性分布[1]，每年造成的经济损失超过30亿美元[2]，不仅给畜牧业带来严重的经济损失，还严重威胁人畜的健康，世界卫生组织(WHO)已将其列为重要的人兽共患病之一[3]。因此，准确及时的检测对于治疗肝片吸虫病显得尤为重要。

目前，酶联免疫吸附法(ELISA)是检测肝片吸虫病应用较多的方法，吸虫感染后2～4周能够检出，且检出率较高；同时具有良好的特异性和敏感性，常用于大范围调查。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在糖酵解和糖异生过程中发挥重要作用。据报道，肝片吸虫在发育过程中其表皮会不断脱落，从而逃避宿主的免疫监视。存在于肝片吸虫表面的GADPH可能在逃避宿主免疫系统攻击过程中具有重要作用[4]。本课题组前期蛋白质组学分析结果显示GAPDH具有成为早期检测抗原的潜力[5]。本研究克隆、表达了肝片吸虫GAPDH重组蛋白，以其作为检测抗原，建立间接ELISA检测方法，验证GAPDH蛋白能否用作肝片吸虫病的早期检测抗原，旨在提供灵敏、特异、快速的早期检测方法。

1 材料与方法

1.1 载体、血清及主要试剂 pMD-18T克隆载体、pCold Ⅰ载体，均购自宝生物工程(大连)有限公司；DH5α、BL21感受态细胞、TMB单组份显色液，均购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶XhoI、SalI、预染蛋白Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司；HRP-兔抗羊IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。以囊蚴人工感染绵羊，采集感染前后的血液分离血清为肝片吸虫阴性、阳性血清。华枝睾吸虫阳性血清由王春仁教授惠赠，日本血吸虫阳性血清由上海兽医研究所惠赠，捻转血矛线虫阳性血清为本实验室储存。

1.2 引物的设计与基因克隆 根据GenBank公布的肝片吸虫GAPDH基因的核苷酸序列设计特异性引物：F：5′-CGCGGATCCATGGCCAATTTTGTGGGT-3′，R：5′-GCGTCGACTCAGGAGTGATCGACGCGG-3′。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,进行35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳并回收纯化。

1.3 表达载体的构建与重组蛋白的诱导表达纯化 将回收纯化后的目的基因亚克隆到pMD-18T载体中，经酶切、PCR、测序鉴定正确的阳性克隆命名为pMD-18T-GAPDH。将从pMD-18T-GAPDH用XhoI、SalI酶切回收的目的基因连接表达载体pCold I，用XhoI、SalI双酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组蛋白表达菌进行测序，并将该重组蛋白表达菌命名为pCold I-GAPDH。重组蛋白表达菌经IPTG诱导后，离心收集菌体，超声破碎菌体，分别收集上清和沉淀，用SDS-PAGE判定重组蛋白的表达形式后，过镍柱纯化蛋白。

1.4 重组蛋白Western blot分析 纯化的重组蛋白经SDS-PAGE判定后转膜封闭。用1∶1 000稀释的一抗(羊肝片吸虫阳性血清)4 ℃过夜孵育后，用1∶5 000稀释的二抗(HRP标记的兔抗羊IgG)进行1 h孵育，洗膜后置于底物显色液中显色，曝光。

1.6 ELISA临床样本检测 用建立好的间接ELISA方法对来自黑龙江省8个县(市)个体养羊户共计96份绵羊血清样本进行检测。

2 结果

2.1 基因的扩增与表达载体的构建 以肝片吸虫cDNA为模板，PCR扩增得到1 014 bp的GAPDH基因目的片段，与预期大小一致。重组表达质粒pCold I-GAPDH经SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，得到4 407 bp的pCold Ⅰ载体片段和1 014 bp的GAPDH目的基因片段；说明GAPDH基因成功插入pCold Ⅰ载体中，见图1。

图1 GAPDH基因PCR扩增(A)和pCold I-GAPDH酶切鉴定(B)结果

2.2 重组蛋白的表达、纯化及Western blot分析 SDS-PAGE分析显示重组蛋白经IPTG诱导后为包涵体表达，在37 kDa处出现明显条带。纯化后蛋白条带单一，大小与预期相符。Western blot分析结果显示，重组蛋白与羊肝片吸虫阳性血清发生反应，说明其具有良好的反应原性，见图2。

图2 蛋白纯化(A)和Western blot分析(B)结果

表1 GAPDH重组抗原浓度和血清稀释度优化

表2 GAPDH间接ELISA方法临界值的判定

表3 GAPDH间接ELISA方法敏感性检测

表4 14 d阳性血清稀释试验结果

表5 GAPDH间接ELISA方法特异性检测

2.4 ELISA临床样本检测 以GAPDH重组抗原包被ELISA检测板，根据优化后的最佳工作条件，对黑龙江省8个县(市)的96份血清样品进行检测，试验结果显示96份样品中共检测出16份肝片吸虫阳性血清，阳性率为16.67%(16/96)，见表6。

表6 临床样本的GAPDH间接ELISA方法检测结果

3 讨论

肝片吸虫病的常规检测主要靠虫卵或虫体检查，虫卵检查只能检测感染晚期(8～12周后)的动物[6]，虫体检查通常是对急性病死动物进行剖检，不适用于活体检测[7]，即这些常规检测都不适用于早期诊断。ELISA是目前应用较多的诊断方法，可在感染后2～4周检出肝片吸虫，有较高的检出率；并且具有良好的特异性和敏感性，快速简便，成本较低且适用于大样本量检测；不需要对动物进行损伤性采样，所以相比于其他检测方法具有更多的优势[8-9]。王丙云等[10]利用肝片吸虫的排泄分泌物作为抗原建立了水牛肝片吸虫病间接ELISA检测方法，其检测敏感性高于虫卵检查法，与虫卵检查法符合率为86.05%。Rickard等[11]以肝片吸虫排泄分泌物作为抗原建立的Dot-ELISA法可以在感染后2周内检测出阳性。刘明旭[12]利用蛋白质组学筛选出来的3种肝片吸虫潜在检测抗原，分别建立间接ELISA方法，检测人工感染绵羊，结果最早检出阳性时间均为14 d。有研究表明，GAPDH能够诱导机体产生短寿命抗体，其对诊断具有重要意义，是一个良好的检测候选抗原[13]。李宇[14]以西氏贝蛔虫GAPDH重组蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA检测方法，结果显示其敏感性为97.92%，特异性为100%，具有良好的稳定性，说明GAPDH抗原具有良好的诊断价值。何冉等[15]对疥螨的GAPDH进行研究，发现其具有良好的免疫原性，具有作为疥螨病检测抗原的潜力。

本研究在表达肝片吸虫GAPDH重组蛋白的基础上，以该蛋白为抗原成功建立了检测肝片吸虫病的间接ELISA方法，其最佳抗原包被浓度为0.375 ng/μL，最佳血清稀释度为1∶400，检测出最早感染时间为14 d，并且与华枝睾吸虫、捻转血矛线虫和日本血吸虫的阳性血清无交叉反应。应用此方法对黑龙江省拜泉、杜蒙、桦南、巴彦、林甸、桦川、密山、梅里斯共8个地区的96份绵羊血清样本进行检测，阳性率为16.67%(16/96)。调查结果显示，8个地区均有羊肝片吸虫的感染，其中杜蒙的感染率最高，达30%，这可能与杜蒙地区多为低洼的沼泽或水泡子有关，该环境有利于肝片吸虫中间宿主小土窝螺的繁殖，造成感染概率高；同时临床样本检测数较少，有可能造成误差。结果表明本研究建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性，可应用于兽医基层羊肝片吸虫病的临床检测。