利用对虾消化腺丝氨酸蛋白酶制备鲍鱼外套膜ACE抑制肽

纪梦雅，万楚君，翁 凌，马 婷，张凌晶，章 骞，曹敏杰

（集美大学海洋食品与生物工程学院，福建厦门 361021）

另一方面，我国是凡纳滨对虾生产大国，2020年产量达186.3万t[1]。同样，在对虾加工过程中也产生了大量副产物。但一般情况下，对虾加工副产物除了用于制备甲壳素外，相当部分被作为垃圾直接丢弃，不仅浪费了大量的自然资源，还造成了环境污染。因此，将水产加工副产物高效利用，具有十分重要的环境和经济效益[4−6]。虾头消化腺含丰富的内源蛋白酶，这些内源蛋白酶以丝氨酸蛋白酶为主，Wu等[7]从太平洋白虾虾头中提取了丝氨酸蛋白酶并进行性质分析，发现白虾虾头丝氨酸蛋白酶活性在pH为8.0～11.0范围内都比较稳定；翁凌等[8]从南美白对虾虾头中提取了丝氨酸蛋白酶，该酶在pH7.0～10.0，40 ℃以下具有较好的稳定性。但目前虾头丝氨酸蛋白酶还未得到广泛的应用。

血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）和激肽释放酶-激肽系统（kallikreinkinin system，KKS）的关键酶。在RAS中，ACE可以将无升压活性的血管紧张素Ⅰ水解为具有升压活性的血管紧张素Ⅱ；同时，在KKS中，ACE可以使具有降压活性的缓激肽降解，从而失去降血压的功能。因此，抑制ACE活性是控制血压上升的一个有效途径[9]。研究发现，体外酶或消化道酶水解蛋白质后释放出的分子量不同的小肽，可被人体直接吸收发挥不同的生理调节功能[10]。迄今为止，已有大量文献报道了ACE抑制肽的相关研究，其中来源于天然食物蛋白，尤其是从海洋食物蛋白中分离制备的ACE抑制肽对血压正常者无副作用，安全性高，是最具研究价值的功能性食品[11−12]。近年来，随着生物活性肽被越来越多的关注，研究者们以动植物蛋白为原料制备了大量降压肽。Lin等[13]研究了军曹鱼皮水解物对ACE的抑制作用，并分离出4种ACE抑制肽。Ketnawa等[14]利用微波和水解法从虹鳟鱼副产物中提取出了ACE抑制肽。Zhang等[15]从水母性腺中纯化得到了具有ACE抑制活性的二肽，并对其进行表征。也有研究者以鲍鱼性腺[16]、内脏[17]和裙边[18]为原料制备ACE抑制肽，但目前国内外还没有以鲍鱼外套膜为原料制备ACE抑制肽的相关报道。

本文拟以鲍鱼加工副产物外套膜为原料，利用从凡纳滨对虾虾头消化腺提取的丝氨酸蛋白酶对其进行酶解，制备具有ACE抑制活性的多肽，并测定其氨基酸序列，分析可能的作用机理，以期为鲍鱼外套膜和虾头的高值化利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活皱纹盘鲍（Haliotis discus hannaiIno） 带壳平均体质量（50.0±4.0）g，购自厦门集美菜市场，带回实验室宰杀取其外套膜，立即使用或暂存于−80 ℃冰箱；凡纳滨对虾消化腺丝氨酸蛋白酶（酶活力为76000 U/mL） 参考本实验室的方法[8]制备；ACE酶（A2580）、马尿酰组氨酰亮氨酸（Hippuryl-histidylleucune，HHL） 美国Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris） 青岛福林生物化学公司；SDS-PAGE标准蛋白、SDS、丙烯酰胺 美国Bio-Rad公司；Tris-base 德国Roche公司；FastBlue蛋白染色液 中科瑞泰生物科技有限公司；甲醇、乙酸乙酯等试剂 均为国产分析纯。

PT-2100组织捣碎机 瑞士Kinematica公司；pH计 美国Denver公司；超滤膜浓缩装置 美国Millipore公司；恒温水浴锅 德国Memmert公司；蛋白质电泳装置 美国Bio-Rad公司；AKTA蛋白纯化系统 美国GE Healthcare公司；GF-260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；凝胶成像仪 英国Syngene公司；Lambda 35紫外分光光度计 美国Perkin Elmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 丝氨酸蛋白酶酶解鲍鱼外套膜过程分析 参照邱娟等[19]的方法，并略作修改。具体操作如下：取10 g鲍鱼外套膜，加入100 mL浓度为20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0），组织捣碎后，在4 ℃，3500 r/min下离心3 min，收集上清液，并取上层细腻沉淀，用少量20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含0.15 mol/L NaCl）复溶后，与上清液混匀即成鲍鱼外套膜前处理液。

取1 mL前处理液置于1.5 mL PE管中，37 ℃预热5 min后，加入0.5%（v/v）的丝氨酸蛋白酶，保持37 ℃，分别在酶解0、5、30、60、120、180、240 min时取样，取样后迅速在95 ℃下加热10 min，冷却后进行SDS-PAGE分析。

中国英语学习者的实验在被试所在中学或大学的教师办公室进行，英语母语者分别在各自所在大学的图书馆中进行，一次仅有一个被试在房间中接受测试。被试首先阅读实验要求，然后开始测试。在电脑的自测步速阅读完成后，被试还要做二语水平测试，并填个人语言背景表。二语水平测试题选自Oxford Proficiency Test，共50道语法选择题，用以检测学生的二语语法水平。所有学生均未在之前做过这一测试。语法选择题每题1分，小于30分被界定为低水平;30～35分为低到中等水平;35分以上为中等以上水平。

1.2.2 SDS-PAGE分析 参考Laemmli[20]的方法分析鲍鱼外套膜蛋白的酶解情况，所用浓缩胶浓度为5%、分离胶浓度为10%。电泳结束后，以Fast Blue蛋白染色液染色，用凝胶成像仪记录结果。

1.2.3 鲍鱼外套膜ACE抑制肽的制备 鲍鱼外套膜ACE抑制肽的制备与1.2.1类似，但鲍鱼外套膜组织捣碎后无需离心，直接37 ℃预热5 min后，加入0.5%（v/v）的丝氨酸蛋白酶，在37 ℃、pH8.0下酶解4 h后，于95 ℃加热10 min终止反应，即得鲍鱼外套膜酶解液。用冰水冷却鲍鱼外套膜酶解液，后将其在6500 r/min下冷冻离心20 min，弃去沉淀，取上清液进行生物活性肽制备。

1.2.4 超滤膜分离 选用截留分子量为3 kDa的超滤膜，将上清液进行超滤分级，收集超滤膜滤过液，冷冻干燥后，用少量20 mmol/L Tris-HCl复溶，测定对ACE的抑制活性。

1.2.5 凝胶色谱分离 将冷冻干燥样品用少量去离子水复溶后，上样于Superdex peptide 10/300 GL凝胶过滤柱（10 mm I.D.×300 mm），洗脱液为去离子水。在流速为0.5 mL/min条件下，测定波长220 nm处的吸光值，收集不同组分（1 mL/管），冷冻干燥后复溶，测定相应组分的ACE抑制活性。

1.2.6 RP-HPLC分离 将Superdex peptide 10/300 GL凝胶过滤柱分离所得ACE抑制活性较强的组分冷冻干燥后复溶，利用GF-260 Agilent HPLC纯化系统进一步分离纯化。色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm），流动相为去离子水（含0.1% TFA）和乙腈（含0.1% TFA），洗脱条件为0～10 min，5%～10%乙腈；10～40 min，10%～40%乙腈；40～60 min，40%～70%乙腈。检测波长220 nm，在流速1 mL/min下，手动收集各活性峰并冷冻干燥，用少量20 mmol/L Tris-HCl复溶后，测定相应组分的ACE抑制活性[18]。

1.2.7 LC-MS/MS鉴定氨基酸序列 将上述复溶样品在13000 r/min下离心10 min，取7 μL样品进行LC-MS/MS分析。按照流速2 μL/min，将样液上样到C18预柱（100 μm×3 cm，3 μm，150 Å）上，保持2 μL/min冲洗脱盐10 min，液相为Eksigent nanoLCUltra™ 2D纳升系统（AB SCIEX）。样品脱盐后再经C18反相色谱柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 Å，Chrom XP Eksigent）分离。质谱采用Triple TOF 5600系统结合纳升喷雾III离子源（AB SCIEX，USA），喷雾电压为2.3 kV，气帘气压为30 psi，雾化气压为5 psi，加热温度为150 ℃[21−22]。

1.2.8 ACE抑制活性的测定 ACE抑制活性测定参考Cushman等[23]方法，并略作修改。实验组将20 μL ACE酶液与20 μL待测样液充分混匀，37 ℃预热5 min，立即加入50 μL 6.5 mmol/L HHL溶液（溶剂为100 mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH8.3，含0.3 mol/L NaCl），37 ℃反应60 min。加入50 μL 1 mol/L盐酸终止反应，再加入300 μL乙酸乙酯，混匀后室温下2553 r/min离心5 min。取上清液200 μL，真空浓缩除去乙酸乙酯后，加600 μL去离子水充分溶解，室温下3610 r/min离心3 min，测定上清液在波长228 nm处的吸光值。对照组用去离子水代替样液，空白组加入盐酸后再加底物，其它条件均与实验组一致。

酶活力单位（U）定义为每分钟内分解HHL底物释放出1 μmol马尿酸（Hippuric acid，HA）所需要的酶量。

式中：A1为对照组的吸光值；As为实验组吸光值；A0为空白组吸光值。

1.3 数据处理

每组ACE抑制率测定均重复三次，采用Excel 2019对实验数据进行误差分析。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE分析

图1为鲍鱼外套膜蛋白在丝氨酸蛋白酶作用下的分解过程。图中，泳道M为标准蛋白，泳道Con1为鲍鱼外套膜全蛋白，大部分蛋白的分子量在30 kDa以上，其中在高分子量（200 kDa）、95 kDa及42 kDa处存在明显的蛋白条带。泳道Con2无蛋白条带，说明所添加的丝氨酸蛋白酶比活力高，酶蛋白背景低，不影响SDS-PAGE分析。鲍鱼外套膜蛋白经对虾丝氨酸蛋白酶酶解4 h后，蛋白基本降解完全，只有34 kDa附近有少量降解产物残留，表明对虾丝氨酸蛋白酶可有效降解鲍鱼外套膜蛋白。

图1 虾丝氨酸蛋白酶水解鲍鱼外套膜全蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of whole proteins in abalone mantle hydrolyzed by shrimp serine proteinase

2.2 鲍鱼外套膜ACE抑制肽的分离纯化

一般地，蛋白水解产物中，低分子量的组分所含的活性多肽含量更高。Fan等[24]在研究废弃蛋鸡肌肉中ACE抑制肽和ACE2上调肽时，用超滤膜分离后发现，小于3 kDa的组分具有较高的生物活性。章禹航等[25]以鲅鱼加工副产物为原料制备ACE抑制肽时发现，超滤得到分子量小于3 kDa的组分具有最高的ACE抑制活性。

本研究利用丝氨酸蛋白酶酶解鲍鱼外套膜蛋白，将酶解液用截留分子量为3 kDa的超滤膜进行超滤分级，测定酶解液和分子量小于3 kDa组分的ACE抑制活性。结果如图2所示，相同浓度下，酶解液和分子量小于3 kDa组分的ACE抑制率分别为13.42%和53.25%。本研究结果表明，经过超滤膜处理后，分子量小于3 kDa的组分（UF-3）的ACE抑制活性明显高于处理前酶解液的抑制活性。

图2 酶解液和UF-3的ACE抑制活性Fig.2 ACE inhibitory activity of the hydrolysate and UF-3

将UF-3冷冻干燥后用Superdex peptide 10/300 GL凝胶柱分离，结果如图3所示。共得到3个峰，分别为F1（第8～25管）、F2（第26～28管）和F3（第29～35管），根据波峰分布情况，收集3个组分，真空冷冻干燥，复溶后测定相应的ACE抑制活性。其中，F2和F3活性较高，而F3生物活性较强且分子量较低，故将其作为重点研究组分。

图3 UF-3生物活性肽的Superdex peptide10/300 GL凝胶过滤（a）及组分的ACE抑制活性（b）Fig.3 Superdex peptide 10/300 GL gel filtration of the bioactive peptides from UF-3 (a) and ACE inhibitory activity of the fractions (b)

大量的文献报道，蛋白酶解物中混合肽的分子量及结构对其活性有一定影响，而ACE抑制活性是由分子量较小的肽段所赋予的，因此低分子量（1～5 kDa）组分中通常包含更多的活性肽[26−27]。由于ACE是分子量为180 kDa的大分子，空间阻碍效应导致分子量较大的肽难于与ACE活性中心产生有效结合并抑制其活性。结晶学研究表明，低分子量肽更容易进入ACE的催化区域[28]，改变其催化活性，特别是0.5～3 kDa的肽对于其活性影响更大[29]。Superdex peptide 10/300 GL凝胶柱在分离肽时，还受如吸附作用等因素的影响，不能完全按肽的相对分子质量大小实现分离。因此，采用RP-HPLC依据疏水性差异对F3继续分离。

研究发现，多肽的亲水-疏水性也是影响其ACE抑制活性的重要因素。因为亲水性多肽很难接近ACE活性中心的疏水“口袋”，所以亲水性多肽一般活性较低或无活性[30−32]。将分离得到的F3组分用RP-HPLC作进一步分离纯化，手动收集主峰后冷冻干燥，复溶后，测定比较相应的ACE抑制活性。结果如图4所示，F3组分经RP-HPLC分离，共收集获得9个峰，依次标记为a～i。结果发现，峰d（28.0 min）、e（29.25 min）、f（29.98 min）、g（33.58 min）和h（47.43 min）的ACE抑制活性较高，其中，峰h的ACE抑制活性最强，利用LC-MS技术对其进行氨基酸序列分析。

2.3 氨基酸序列分析

对图4a中ACE抑制活性最强的峰h进行质谱鉴定，结果如图5所示。共获得65个离子峰，得到5个肽段，序列依次为P1：LVNEVTEFAK，P2：VDE VGGEALGR，P3：MFLSFPTTK，P4：VATVSLPR，P5：LGDSFYYGK。它们的分子量分别为575.31、551.27、536.27、421.74和525.24 Da，说明峰h并不是由单一的肽所产生的，而是多个肽的混合物。将得到的五个肽段与NCBI蛋白数据库进行同源性分析得知，P1与血清白蛋白，P2与血红蛋白β链，P3与α珠蛋白，P4与肌浆钙结合蛋白，P5与丝氨酸蛋白酶均有100%的同源性。由于水解鲍鱼外套膜蛋白的丝氨酸蛋白酶是高度纯化的，因此，推测P1、P2、P3、P4均来源于鲍鱼，而P5则来自对虾丝氨酸蛋白酶。利用AHTPDB降压肽数据库（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/pepsearch.php）检索发现，5个肽均为新型ACE抑制肽。

图4 F3生物活性肽的RP-HPLC分离纯化（a）及组分生物活性（b）Fig.4 Separation and purification of bioactive peptides from F3 by RP-HPLC (a) and bioactivity of the fractions (b)

图5 峰h中生物活性肽的分子量鉴定及氨基酸序列分析Fig.5 Identification of molecular mass and amino acid sequences of peptides from peak h

Natesh等[33]通过晶体学研究证明，ACE的活性位点不能容纳分子量较大的多肽分子。因此，大多数ACE抑制肽长度较短，一般为2～12个氨基酸残基。但ACE抑制肽的活性不仅与分子量大小有关，还与氨基酸的组成和序列密切相关。如C端的3个氨基酸中如有一个是疏水性氨基酸，则该ACE抑制肽具有较高的活性；N端含侧链脂肪酸族氨基酸如Val和Ile等可以提高该肽的活性[30,34]。此外，带正电荷的Lys（ε-氨基）和Arg（胍基）作为C末端也有助于提高其ACE抑制活性[35]。本研究纯化获得的肽C端均为Lys或Arg，二者虽属于亲水性氨基酸，但均带正电荷，且肽N端均含脂肪族氨基酸，有助于提高ACE抑制活性。

综上，本文所得纯化肽符合ACE抑制肽的氨基酸组成特点，但其结构特性及其肽构效关系还需深入研究。接下来，拟通过合成上述ACE抑制肽，继续探究其消化吸收性能和降血压功效，并利用分子对接技术探讨这些肽段与ACE的可能结合位点与结合方式，以期为相关功能性食品的开发提供理论参考。

3 结论

本研究以水产品加工副产物虾头和鲍鱼外套膜为原料，提取虾头消化腺丝氨酸蛋白酶酶解鲍鱼外套膜蛋白制备ACE抑制肽。结果表明，虾头丝氨酸蛋白酶可有效降解鲍鱼外套膜蛋白，酶解液中分子量低于3 kDa的组分ACE抑制率为53.25%，利用Superdexpeptide 10/300 GL凝胶柱和RP-HPLC对该组分进一步纯化并经LC-MS/MS鉴定得到5个肽段，其中4个是来源于鲍鱼的新型ACE抑制肽。本研究利用水产品加工副产物，实现虾头消化腺蛋白酶一步酶解鲍鱼外套膜，再经超滤得到具有较高ACE抑制活性的组分，这不仅有利于扩大天然ACE抑制肽的来源，实现鲍鱼、对虾加工副产物的高值化利用，还可以降低相关功能性食品的生产成本。未来，将对利用鲍鱼外套膜酶解物开发功能性食品展开研究。