水稻OsNRAMP5基因低镉积累突变位点功能标记的开发与验证

于江辉　李焱瑶　秦冠男　翁绿水　蒋显斌　邓力华

摘要：為了对水稻低镉积累基因进行精准检测和世代跟踪，提高低镉积累水稻品种的分子标记辅助育种（MAS）选育效率，基于籼稻品种9311及其低镉积累突变体lcd1材料7号染色体上OsNRAMP5基因第7外显子单核苷酸的突变，参照四引物扩增受阻突变PCR（Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR，Tetra-primer ARMS-PCR）原理设计了共显性功能标记nra5fun，且采用PCR方法分别对18份籼稻、18份粳稻及金23B/lcd1杂交F1代材料进行分子标记特异性验证。电泳结果表明，含OsNRAMP5基因SNP突变材料lcd1可扩增出大小为723 bp、210 bp的条带，含野生型OsNRAMP5基因的材料9311可扩增出大小为723 bp、557 bp的条带，金23B/lcd1 F1代杂合型材料可扩增出大小为723 bp、557 bp、210 bp的条带，共显性标记nra5fun得到的电泳条带与引物设计时预测的目标片段完全吻合;Sanger测序结果表明，电泳扩增条带片段的序列与目的基因的DNA序列和SNP突变位点的序列一致;18份籼稻和18份粳稻种质资源均能扩出大小为723 bp、557 bp 2个目的条带，说明这些材料均不含有OsNRAMP5基因的单个SNP突变，表明该标记特异性较高。因此，开发的功能标记nra5fun能够准确、高效地识别水稻低镉积累基因的纯合突变型、纯合野生型和杂合型，可在水稻低镉积累分子育种中推广应用。

关键词：水稻;低镉;分子标记;分子育种;OsNRAMP5基因

中图分类号：S511.035.3文献标识码：A文章编号：1000-4440（2022）02-0289-07

Development and validation of functional markers of low-cadmium accumulation mutation sites in rice OsNRAMP5 gene

YU Jiang-hui LI Yan-yao QIN Guan-nan WENG Lü-shui JIANG Xian-bin DENG Li-hua

Abstract：The purpose of this study is to achieve accurate detection and generation tracking of low cadmium accumulation genes in rice， and improve the efficiency of molecular marker assisted selection （MAS）. There was a single nucleotide mutation in exon 7 of OsNRAMP5 gene on chromosome 7 between the indica rice 9311 and the mutation lcd1， and the co-dominance functional marker nra5fun was developed according to tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR. PCR was used to verify the molecular marker specificity of 18 indica rice， 18 japonica rice and Jin23B/lcd1 hybrid F1 materials. Electrophoretic detection results showed that the mutant material lcd1 containing OsNRAMP5 gene could be amplified 723 bp and 210 bp bands， the 9311 containing wild-type OsNRAMP5 gene could be amplified 723 bp and 557 bp bands， and the heterozygote Jin23B/lcd1 could be amplified 723 bp， 557 bp and 210 bp bands. The electrophoresis bands obtained by co-dominant marker nra5fun were consistent with those of the predicted target fragments. Sanger sequencing results showed that the sequence of amplified fragment was consistent with the DNA sequence of the target gene and the sequence of single nucleotide polymorphism（SNP） sites. Two target bands with lengths of 723 bp and 557 bp were amplified from 18 indica and 18 japonica germplasm resources， indicating that these cultivars did not contain single SNP mutation of OsNRAMP5 gene. So， the marker had high specificity. In conclusion， the functional marker nra5fun can accurately and efficiently identify homozygous mutant， homozygous wild type and heterozygous type of low cadmium accumulation genes in rice， and it can be widely used in the breeding of low cadmium rice cultivars.

Key words：rice;low-cadmium;molecular marker;molecular breeding;OsNRAMP5 gene

水稻（Oryza sativa L.）是全球近半数人口的主要粮食作物，是中国仅次于玉米的主要粮食作物，广泛分布于中国六大稻区。随着工农业的高速发展和城市化进程的推进，土壤重金属污染已经成为世界范围内的一个重要环境问题，中国面临的形势更加严峻[1]。同时，由于工业“三废”的不合理排放、污水的大量灌溉、污泥的大量利用、农药及化肥的过量使用等原因，使得土壤中的重金属镉（Cd）含量持续增加，Cd污染日益严重[2]。研究发现，水稻比其他谷类作物更容易积累Cd，且Cd可以通过根系在植株中运输和积累，尤其是在可食用的稻米部分，而Cd在稻米中的积累威胁到了粮食安全[3-4]。特别是近年来，中国南方出现的“镉大米”引起了人们对大米等农产品Cd污染的极大关注[5]。此外，相关研究发现，高浓度的土壤Cd污染会导致水稻减产[6]。2005年的调查数据显示，中国受Cd污染的耕地面积近1.33×104 hm2，由此每年造成粮食减产在1×107 t以上，受Cd污染的稻谷近2×106 t，直接经济损失超过2×1010元[7]。为了避免水稻中Cd积累过量，近年来科学家们提出并研究了一些降低水稻籽粒中Cd积累量的技术措施，主要包括使用物理、化学和生物方法阻碍稻田Cd经根系进入植株体内、适当配施有机肥和化肥、采用间作或作物轮作、适当采用田间淹水管理等农艺调控措施， 以及利用分子生物学和遗传学方法培育低Cd积累水稻品种的育种调控措施等[8]。其中，培育低Cd积累水稻品种被认为是减少稻米Cd含量效果最好和最经济的方法[9]。可以看出，低Cd积累水稻品种的选育，对人体健康、食品安全、粮食稳产和环境保护等具有重大意义。

近年来，研究人员在探索植物吸收Cd的生理、生化及分子生物学的过程中，相继挖掘、研究了许多调控或参与调控水稻Cd吸收、运输和积累的相关蛋白质。目前，研究者至少已经克隆了34个相关基因，其中一些关键基因的发现对水稻低Cd积累育种具有重要的应用价值[5， 10]。OsHMA3是一个位于7号染色体上的控制水稻Cd积累的基因，是P1B类型的重金属ATP酶（HMA）基因家族成员，该基因的表达主要在根部，相关研究发现，水稻中有9个HMA基因，过表达OsHMA3会抑制Cd从水稻根系向植株的运输，因此过表达OsHMA3基因能显著降低稻米Cd含量，而不影响其他微量元素含量[11-13]。OsCd1是位于水稻3号染色体上的一个与谷粒Cd积累相关的基因，它属于膜转运蛋白质的主要协同转运蛋白超家族（Major facilitator superfamily， MFS）基因，主要在根细胞的质膜中表达。粳稻的主要基因为OsCd1V449，籼稻的主要基因为OsCd1D44，在籼稻中导入粳稻OsCd1V449基因可显著降低谷粒Cd含量，且对植株生殖生长和产量等性状无显著影响[14]。水稻自然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural resistance-associated macrophage protein，NRAMP）基因是一种高度保守的二价金属离子转运蛋白质家族基因成员，目前在水稻基因组中发现的NRAMP基因有7个，其中OsNRAMP5位于其根、外皮层的远端，因此在根内具有较高表达量，其编码的蛋白质位于细胞质膜上，主要参与根系对锰（Mn）和Cd的吸收[15]。研究发现，OsNRAMP5基因敲除或表达量的减少会显著降低水稻对Cd、Mn的吸收量，從而导致其对Cd的积累量减少，但在低Mn环境下会影响植株的生长，同时也会影响植株产量[16-20]。而Chang等[21]研究发现，虽然过量表达OsNRAMP5基因促进了根系对Cd和Mn的吸收，但是由于Cd在木质部径向运输的中断，使得Cd从根到茎的运输量减少，导致稻米中的Cd含量降低了49%～94%。有研究发现，通过水稻OsNRAMP5基因的突变亦可显著降低稻谷中Cd含量[22-23]。Ishikawa等[22]利用碳离子束辐射日本水稻品种越光获得了3个低Cd突变体，研究发现，由于OsNRAMP5基因突变，导致Cd的积累量显著减少。Cao等[23]利用甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate， EMS）对籼稻品种9311进行诱变，获得低Cd积累突变体lcd1，进一步鉴定发现，在不同Cd污染试验田，突变体lcd1稻谷Cd含量仅为0.02～0.13 mg/kg，而野生型9311稻谷Cd含量达1.02～4.44 mg/kg，可能由于OsNRAMP5基因的1个碱基的突变，导致稻谷Cd积累量的大幅度降低。本研究基于突变材料lcd1中OsNRAMP5基因1个碱基的单核苷酸突变，参照四引物扩增受阻突变PCR（Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR，Tetra-primer ARMS-PCR）原理，设计出含4条引物、与OsNRAMP5基因突变位点共分离的共显性功能标记，进一步利用该标记对不同水稻种质资源和金23B/lcd1的杂种F1代植株通过PCR扩增进行验证，以期开发出功能标记为低Cd积累水稻材料的分子育种研究奠定基础。

1材料与方法

1.1参试材料

供试水稻材料：含有OsNRAMP5基因SNP突变的材料lcd1[23]，由湖南省水稻研究所提供;18份来自不同地区的籼稻品种（R1044、R43-02、R1269、华占、荃9311B、野香B、金23B、农香42、R106、R299、R900、广恢390、农香39、岳恢9113、珞红5B、望恢006、黄华占、湘早籼45），包括常规籼稻、野生型保持系、红莲型保持系;18份来自不同地区常规粳稻品种（长粒香、吉粳1、吉粳88、辽粳287、龙粳5号、宁粳4号、千重浪2号、中花11、东稻2号、东稻3号、东稻4号、绥粳4号、越光、长白10号、长选10、东农416、龙粳21、长白9号）;金23B/lcd1（杂交F1代材料）、对照籼稻品种9311。上述籼稻、粳稻、杂交F1代材料由笔者所在课题组保存或改造。

1.2OsNRAMP5基因SNP突变功能标记的设计与合成

突变材料lcd1 7号染色体上OsNRAMP5基因的第7外显子的8 887 787位单核苷酸的隐性突变，会导致lcd1籽粒Cd含量急剧降低。研究发现，突变体lcd1中该位点的碱基为T，而野生型籼稻9311中该位点的核苷酸为C[23]。因此，笔者针对OsNRAMP5（基因位点：BGIOSGA024510、Os07g0257200）基因编码区8 887 787位点存在的单个SNP，参照ARMS-PCR的分子标记原理，设计了由4引物（表1）组成的功能标记nra5fun，在引物nra5fun-af、nra5fun-ar、nra5fun-bf中各设计了1个错配碱基，在引物nra5fun-br中分别设计了2个错配碱基（表1中的小写字母）。使用在线工具Primer3web（http：//primer3.ut.ee/）、Primer BLAST进行引物设计、引物Tm值（指在模板DNA过量的情况下，有50%的引物与模板精确配对，50%的引物处于解离状态时的温度）筛选及引物特异性评估等。由北京擎科新业生物技术有限公司完成nra5fun功能标记引物的合成和目的DNA片段的测序。

1.3DNA提取与分子标记检测

水稻移栽14 d后取供试材料的叶片，用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取DNA。用10 μl PCR扩增体系对供试材料的目的片段进行扩增，体系组分：5 μl 2×Rapid Taq Master Mix（由南京诺唯赞生物科技有限公司合成），1 μl 10 μmol/L表1中的4种引物等量混合物（经验证调整后，4种引物按1∶1∶1∶2的比例进行混合PCR效果较好），1 μl DNA模板，3 μl ddH2O。在55.0～62.0 ℃进行最适退火温度探索，最后确定最佳退火温度为61 ℃。用质量分数为3.0%的琼脂糖凝胶电泳检测本试验的PCR扩增产物。

2结果与分析

2.1nra5fun功能标记的开发

根据OsNRAMP5基因单个SNP的突变（C→T），本研究开发了4条引物的突变功能标记nra5fun（图1）。首先设计1对外引物nra5fun-af和nra5fun-ar作为对照，并各引入1个错配碱基， 野生型和突变型水稻材料均可以扩增出大小为723 bp的条带，且扩增产物都包含功能性SNP位点，然后根据SNP突变位点设计2条反向内引物nra5fun-br和nra5fun-bf，其中引物nra5fun-br与突变型基因匹配，其3′端对应突变碱基T，引物nra5fun-bf与野生型基因匹配，其3′端对应碱基C。同时为了进一步增强PCR目的条带的特异性扩增，在引物nra5fun-br 5′端第6、10位分别设计错配碱基G，在引物nra5fun-ar 5′端第6位设计错配碱基T。参照4条引物设计策略进行预测：引物nra5fun-br/nra5fun-af可扩增出大小为210 bp的条带，为突变型材料lcd1特有条带;引物nra5fun-bf/nra5fun-ar可扩增出大小为557 bp的条带，为野生型籼稻9311特有条带。由此可见，突变型纯合体可扩增出2个条带，大小分别为723 bp和210 bp;而野生型纯合体亦可扩增出2个条带，大小分别为723 bp和557 bp;杂合型材料可扩增出3个条带，大小分别为723 bp、557 bp、210 bp。

2.2nra5fun功能标记的验证和退火温度对标记检测效果的影响

相关研究结果表明，退火温度对PCR反应的影响较大，提高目的条带的特异性需要较高的退火温度，但会降低其扩增量，而退火温度较低会因PCR反应目的片段的特异性不够高而导致假阳性[24]。为了验证nra5fun分子标记的准确性及确定最佳退火温度，本研究将4条引物按相同组成比例进行PCR扩增，且在不同退火温度下扩增特异性条带。由图2可以看出，当退火温度为55～62 ℃时，引物nra5fun-af/nra5fun-ar均能扩增出大小为723 bp的条带，引物nra5fun-bf/nra5fun-ar均可扩增出大小为557 bp的条带，可见外引物nra5fun-af、nra5fun-ar和内引物nra5fun-bf对退火温度不敏感。由于内引物nra5fun-br中设计了2个错配碱基，因此PCR反应目的条带的特异性扩增需要较高的退火温度。结果表明，当退火温度为55～60 ℃时，突变型、野生型、杂合型水稻均可扩增出大小为210 bp左右的条带，当退火温度达到61 ℃或62 ℃时，突变型（lcd1）和杂合型（金23B/lcd1）水稻均扩增出了大小为210 bp左右的条带，而野生型水稻（9311）未扩增出条带，表明nra5fun功能标记最适的退火温度约为61 ℃。综上所述，当退火温度为61 ℃时，含OsNRAMP5基因SNP突变材料lcd1扩增出了大小为723 bp、210 bp的条带，含野生型OsNRAMP5基因的9311水稻材料扩增出了大小为723 bp、557 bp的条带，杂合型金23B/lcd1水稻材料扩增出了大小为723 bp、557 bp、210 bp的条带。由此可见，共显性标记大小与预测的目标片段大小一致。

为了进一步确认nra5fun功能标记物在61 ℃或62 ℃退火条件下PCR产物的准确性，对退火温度为61 ℃时突变型、野生型材料PCR产物中的最大片段（723 bp）分别进行切胶回收，并进行Sanger测序，由图3可以看出，lcd1突变型、9311野生型水稻材料7号染色体上的8 887 787位核苷酸分别对应A和G（互补链为T、C），DNA序列其他碱基无差异，与图1的结果一致。

2.3nra5fun功能标记对不同水稻种质资源的验证

由于本研究在设计内部引物时，与突变型基因匹配的nra5fun-br引物内部引入了2个错配碱基，导致目标条带扩增效率降低，条带较浅（210 bp大小，图2）。因此为了提高内引物nra5fun-br的扩增效率，在进行PCR扩增时，将4条引物nra5fun-af、nra5fun-ar、nra5fun-bf、nra5fun-br的用量配比调节为1∶1∶1∶2。电泳结果显示，引物nra5fun-br/nra5fun-af扩增210 bp条带的效率明显提高，且另2种条带的扩增效率未受影响（图4）。为进一步验证nra5fun功能标记在不同水稻品种（品系）基因分型中的准确性，利用该标记对不同来源的18份籼稻、18份粳稻种质资源进行PCR扩增和电泳检测。由图4可知，18份秈稻或粳稻种质资源中均能扩增出大小为723 bp、557 bp的目标条带，且扩增不出大小为210 bp的条带类型，说明这些材料均不含有OsNRAMP5基因单个SNP（C→T）的突变。综上所述，利用功能标记nra5fun可以准确、快速地判断对应水稻材料中是否含有低Cd积累基因OsNRAMPS单个SNP突变位点，可为低Cd积累水稻品种的选育提供新的分子标记辅助选择。

3讨论

分子标记辅助育种（Molecular marker-assisted selection，MAS）利用与目的基因共分离的连锁标记或目的基因自身的功能标记来鉴定杂交改良后代的基因型，因其操作快速且准确，可提高育种效率和缩短品种稳定的年限，目前已成为水稻等农作物重要性状改良的有效方法。但是，连锁标记与目的基因之间可能发生重组交换，因假阳性导致目的基因丢失，而目的基因自身的功能标记与其完全耦合，避免了连锁标记存在的遗传冗余和重组问题，提高了MAS选择的效率和准确性[25]。目前，针对基因内碱基突变差异设计分子标记的方法主要有2种，分别为限制性内切酶酶切（CAPS或者dCAPS）和扩增受阻突变PCR（Amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR），其中ARMS-PCR是最經济且应用最广泛的方法[26]，且在此基础上开发的四引物扩增受阻突变PCR（Tetra-primer amplification refractory polymorphism system-PCR，Tetra-primer ARMS-PCR），通过单次PCR扩增就可将野生纯合型、突变纯合型、杂合型进行有效区分[27-28]。本研究利用来自籼稻9311的突变体材料lcd1的7号染色体上OsNRAMP5基因第7外显子的8 887 787位单个SNP突变[23]，参照Tetra-primer ARMS-PCR原理，利用四引物扩增受阻法设计了功能标记nra5fun，可以将突变型、野生型、杂合型水稻材料有效区分，并且对来自不同地区的籼稻、粳稻各18份种质资源进行PCR验证。电泳结果表明，扩增出与野生型9311同样的条带类型，证明该标记的准确性和特异性，且该标记方法操作简单、扩增快速准确，在实际应用中优势明显，可以实现对OsNRAMP5基因材料的准确检测，从而可以广泛应用于水稻低Cd积累资源的鉴定和MAS育种中。此外，参照前人的引物设计策略[26， 29]，本研究在设计外引物时，分别引入单个错配碱基，结果没有影响引物与模板DNA的特异性结合和目的片段的PCR扩增效果。据报道，由于Tetra-primer ARMS-PCR引物在同一个扩增体系中，导致目的片段扩增效率和特异性受引物用量比、酶浓度和退火温度的影响[27]。由于本研究在设计与突变基因匹配的内引物nra5fun-br时引入了2个错配碱基，导致目的条带扩增效率降低，条带较浅。基于前人的研究结果[25-27]，本试验将引物nra5fun-br摩尔质量比提高了1倍后再次进行PCR，结果表明，目的条带扩增效率明显提高，达到了基因检测的预期效果。同时，nra5fun功能标记对退火温度的特异性较高，在退火温度达到61 ℃或62 ℃时才可避免假阳性，为此，对61 ℃退火温度的扩增产物进行测序的结果证实了所扩增目的片段的准确性。前人对SNP突变基因分子标记的开发也有相同的试验结果[27]。

近年来，研究者关于水稻根系对Mn、Cd吸收的OsNRAMP5基因进行了大量研究，旨在剖析该基因的作用机制和培育低Cd积累水稻品种[15-23]。Tang等[30]利用CRISPR/Cas9对隆两优华占亲本OsNRAMP5基因进行编辑，敲除该基因后培育出的两优低镉1号稻米的Cd积累量比野生型隆两优华占降低了98%以上，而且产量间无显著差异。此外，研究者通过靶向编辑不同遗传背景水稻材料的OsNRAMP5基因，亦获得了一些低Cd积累的水稻品系[17-18]。但是上述通过基因编辑手段改变OsNRAMP5基因表达量培育的“去镉”水稻属转基因材料，目前无法商业化应用， 因此需要在诱变等育种技术的应用上进行创新，加快培育非转基因“去镉”水稻种质或品种[5]。Ishikawa等[22]采用碳离子束辐射日本优质品种越光得到3个低Cd积累突变体，其中突变体lcd-kmt1与lcd-kmt2不仅稻米Cd含量显著下降，而且农艺性状和品质与越光相比无明显差异，同时lcd-kmt2获得新品种登记并命名为Kan1[31]。Cao等[23]用化学试剂甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate， EMS）诱变籼稻材料9311得到低Cd积累突变体lcd1，种植于不同稻田lcd1材料谷粒中Cd含量仅为0.02～0.13 mg/kg，且产量等重要农艺性状与9311无差异。由此可见，突变体lcd1具有极大的育种价值。本研究就突变材料lcd1 OsNRAMP5基因的单个SNP突变碱基设计了功能标记nra5fun，在低Cd积累品种MAS的选育中具有重大应用前景。笔者认为，可以将目前各稻区的主推品种、当家品种或具有较大应用潜力的育种品系作为受体材料，将突变体lcd1作为供体材料，通过杂交渗入低Cd积累基因，通过回交利用功能标记nra5fun进行世代检测直至材料稳定，即可创制出农艺性状与受体材料无差异的低Cd积累新品系。而且本研究利用四引物法设计的共显性功能标记nra5fun可以区别杂交改造后代材料的纯合型或杂合型，在回交选育中材料更容易稳定，可以有效缩短育种年限，提高低镉积累水稻品种的选育效率。

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（责任编辑：徐艳）

收稿日期：2021-09-05

基金项目：国家自然科学基金联合基金项目（U19A2025）

作者简介：于江辉（1986-），男，内蒙古乌兰察布人，硕士，助理研究员，主要从事水稻分子育种研究。（E-mail）yujianghui@isa.ac.cn。李焱瑶为共同第一作者。

通讯作者：蒋显斌，（E-mail）350139343@qq.com;邓力华，（E-mail）denglihua@isa.ac.cn