小飞鼠微卫星位点的筛选及遗传特征分析

田新民 杨孟平 宋雅祺 刘小慧 廉明栋 陈 红

(牡丹江师范学院生命科学与技术学院，牡丹江，157011)

小飞鼠(Pteromysvolans)隶属哺乳纲(Mammalia)啮齿目(Rodentia)鼯鼠科(Pteromyidae)飞鼠属，为树栖夜行滑行类物种，主要分布于欧亚大陆北部，国内主要分布在东北、华北、西北等北方林区[1-3]。由于不合理的森林采伐，森林生境趋于破碎化甚至丧失，已导致全球许多地区的小飞鼠种群处于濒危状态[4-5]。作为森林可持续经营的重要指示和伞护物种[6]，我国也将其列为“易危”与“三有”重点保护的野生动物[7-8]。目前，国外在小飞鼠巢址选择、家域、扩散、遗传多样性和分子系统进化等领域已开展系列研究[9-13]，为该物种的科学保护提供了参考，而我国对小飞鼠生态学领域的研究基本空白。

保护遗传学研究在揭示濒危物种遗传适应与濒危机制、实现物种的精准保护与管理方面发挥了重要的作用，微卫星分子标记以选择中性、多态性高及共显性等优点，在保护遗传学领域有广泛应用[14]。由于微卫星侧翼序列在物种间的高度保守性，表现出近缘物种间的引物通用性，从而可实现从近缘物种微卫星中筛选出目标物种的位点，实现该物种的群体遗传学研究[15-16]，相比其他筛选策略，这是一种低成本与高效率的方法。本研究对小飞鼠其他亚种、近缘物种的微卫星位点进行测试筛选，构建小飞鼠东北亚种(P.v.arsenjevi)的微卫星分析系统，藉以为该亚种的保护遗传学领域深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本与DNA提取

在伊春市五营区龙江松鼠养殖场共收集30只自然死亡的小飞鼠，此样本均为东北亚种野外个体的繁殖后代。从这些个体的腿部取肌肉组织，采用血液/细胞/组织基因组DNA试剂盒(天根，北京)提取基因组DNA。用ND-1000紫外分光光度计(Nanodrop，USA)测定DNA浓度，稀释至10 ng/μL，4 ℃存放备用。

1.2 PCR扩增

根据GenBank中已报道的微卫星位点，结合文献[17-22]，选取鼯鼠科小飞鼠指名亚种(P.v.volans)、北美飞鼠(Glaucomyssabrinus)、海南小飞鼠(Hylopetesphayrei)和赤颊林飞鼠(H.sagitta)，以及松鼠科(Sciuridae)北松鼠(Sciurusvulgaris)5个物种中扩增效果较好的34对引物(表1)，以小飞鼠东北亚种的DNA为模板进行扩增。采用不同退火梯度，对微卫星位点初步筛选；成功扩增的位点，上游引物5′端进行荧光标记(Fam、Hex、Tamra或Rox)。扩增体系20.0 μL：5 U/μL ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa，Japan)0.1 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.5 μL，超纯水13.8 μL。PCR反应条件均为：94 ℃，4 min；(94 ℃，30 s；50～59 ℃，30 s；72 ℃，30 s)× 35 个循环；72 ℃，10 min。扩增产物经过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其中荧光标记引物成功扩增的PCR产物用ABI 3730XL测序仪(Applied Biosystems Inc.，America)进行毛细管电泳检测，判读等位基因大小。所有的引物合成和基因分型均由上海生工完成。

表1 鼯鼠科和松鼠科物种的微卫星位点信息

续表1

1.3 数据处理

采用软件GENALEX 6[23]计算各位点的等位基因数、观测杂合度和期望杂合度；Excel microsatellite tool kit[24]计算各位点的多态信息含量(polymorphic information content，PIC)。采用软件GENEPOP 4.0[25]测算各位点是否符合Hardy-Weinberg平衡，位点间的连锁不平衡情况和概率检验使用马尔可夫链法(Markov chain method)，参数设置：dememorization=10 000；batch=20；iteration=5 000，以Bonferroni法对检验的显著性进行修正。对于多态性位点，采用软件GIMLET 1.3.3[26]计算位点的个体联合判别率(probability of identity，PID)，PID指无亲缘关系或同胞个体之间具有相同基因型的概率。

2 结果与分析

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测发现，共有14个位点有明确的符合微卫星片段大小的扩增产物，占筛选位点总数的41.2%。毛细管电泳(表2)显示，上述14个位点均能进行准确的基因型判断，但是位点Hlep26和GLSA48只有1个等位基因。其余12个位点Pvol10、Pvol41、PvolE1、PvolE5、PvolE6、PvolE10、Scv3、Hlep59、Hlep72、Hlep80、Hph17和ScnFO35的等位基因8～16个，多态信息含量为0.757～0.902，均为高度多态性位点，占可扩增位点的85.7%(12/14)。

12个高度多态性位点的观测杂合度为0.500～0.950，期望杂合度为0.775～0.909，其中，有6个位点(Pvol41、PvolE6、Hlep59、Hlep72、Hph17和ScnFO35)符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.123～0.998)；其余6个位点(Pvol10、PvolE1、PvolE5、PvolE10、Scv3和Hlep80)都偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，皆呈现不同程度的杂合度不足(表2)。在12个位点中，均未检测到连锁不平衡现象。Gimlet分析显示，12个微卫星位点的个体联合判别率很高，2只个体具有相同基因型的无偏概率为3.49×10-22；即使全同胞个体，错误判别概率Prod(sibs)也只有1.44×10-6。多态性最高的前6个位点(Hlep59、PvolE1、PvolE5、Pvol10、Pvol41和Hlep72)扩增失败时，全同胞错误判别概率也只上升到0.16%(图1)。

表2 14个微卫星位点在小飞鼠种群中的遗传特征

图1 12个微卫星位点按照个体联合判别率顺序的个体基因型相似概率曲线Fig.1 Probability of identity(PID)curve generated 12 microsatellite loci

3 讨论

微卫星侧翼序列的保守性，是近缘物种间位点交叉扩增的基础，为许多物种的遗传管理提供了极大的便利[14-16，27-29]。本研究选择了鼯鼠科与松鼠科中5个物种(小飞鼠指名亚种、北美飞鼠、海南小飞鼠、赤颊林飞鼠和北松鼠)内高多态性的34个微卫星位点，在小飞鼠东北亚种内共获得12个具有多态性的位点，成功率为35.3%，其中，同物种小飞鼠指名亚种的位点在东北亚种内多态性扩增成功率最高，为85.7%(6/7)；同为鼯鼠科不同属的海南小飞鼠和赤颊林飞鼠的成功率次之，为75.0%(7/8)；松鼠科的北松鼠最低，为12.5%(1/8)。由此可以看出，近缘种基因组序列相似度高，交叉扩增成功概率高，而远源种之间情况呈相反的趋势[15]。例外的是，在鼯鼠科的北美飞鼠11个微卫星位点内，仅有1个位点能够扩增成功，并无多态性。

本研究检测到12个多态性微卫星位点，其中有6个位点偏离Hardy-Weinberg平衡。相关研究认为，导致位点和群体偏离Hardy-Weinberg平衡的原因有很多，如种群亚结构、近亲交配、迁入和迁出等[29-30]。在这6个位点中，均呈现一定程度的杂合度不足。本研究样本来自笼养的繁殖个体，可能受到近亲交配的影响，导致了位点偏离Hardy-Weinberg平衡。得到的12个位点均为高度多态性位点(PIC值>0.5)，其个体联合判别率很高；仅使用相比多态性略低的6个位点(PvolE6、PvolE10、Scv3、Hlep80、Hph17和ScnFO35)，全同胞错误判别概率也小于1%(0.16%)。因此，本研究筛选的12个多态性位点，可作为非损伤性遗传取样个体识别的参考位点，也可为小飞鼠东北亚种群体遗传学研究与管理提供重要的分子标记。