程序降温仪冷冻法和液氮熏蒸法冷冻精子复苏效果比较

何红梅 余雄武 左奎 刘林燕 孙丽 李凤琼

摘要：目的：比较程序降温仪冷冻法和液氮熏蒸法冷冻人类精子复苏及复苏24小时后运动能力的差异。方法：对来自本院男科实验室50份精液标本分别应用程序降温仪冷冻法和液氮熏蒸法分别进行冷冻保存，液氮熏蒸法使用1.8ml和0.5ml两种冷冻载体。复苏后的精子以及复苏后24小时的精子分别比较前向运动精子百分率（a+b级）%、快速前向精子百分率a%及曲线速率（VCL）、直线速率（VSL）、平均路径速率（VAP）等参数。结果：应用程序降温法冷冻精子复苏后（a+b级）%、a%及VCL、VSL、VAP等参数与液氮熏蒸法两种冷冻载体复苏后的精子运动参数比较无显著差异（ P>0.05）。程序冷冻法复苏后精子经上游处理24小时后前向运动精子百分率（a+b级）%、快速前向精子百分率（a级）%、VCL、VSL、VAP等参数与液氮熏蒸法各组参数比较无显著性差异（P>0.05） 。结论：液氮熏蒸法冷冻人类精液在存活率和运动能力等方面不逊于程序降温仪冷冻法，两者均适于人类精液的冷冻保存。

关键词：精液保存;程序冷冻法;液氮熏蒸法;上游法。

部分不孕患者在实施体外授精胚胎移植（in vitro fertilization，IVF）过程中可能会出现取精极度困难或因个人因素（如女方取卵当日男方无法来医院取精的情况），对于这部分男性患者，提前冷冻保存一份精液可以作为取精日的备用选择。程序冷冻法、液氮熏蒸法是常见的用于人类精液冷冻保存的两种方法。这两种方法在精液冷冻复苏过程中，都可能会形成冰晶，而冰晶形成过大或过多会不可避免地损伤精子结构，影响精子的功能[1]，这会影响复苏后精子的存活率和运动能力，而精液冷冻复苏后的活率及运动能力是决定成功受精乃至临床妊娠的重要因素[2]。为了比较程序冷冻法、液氮熏蒸法冷冻保存人类精子的效果，我们对2019年1月至2021年12月间在我院治疗不孕患者的50份精液标本分别进行了两种方法的冷冻保存，并比较了复苏后及复苏上游处理24小时两组的差异，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1一般资料：精液标本均来自本院生殖中心男科实验室的患者，共50份，所有用于研究的精液标本均已征得患者知情同意。精液质量分析按照WHO《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》（ 第4版）进行精液常规分析。标本纳入标准：患者年龄25-40岁，精液量≥2ml，精子密度≥50%，存活率≥50%，禁欲时间控制在2～7天。通过手淫法收集精液于无毒、无菌取精杯中，待精液液化后，充分混匀，用定量移液器吸取10μl精液标本置于makler精子计数板（以色列）上，使用SSA-Ⅱ型计算机自动检测分析系统（computeraided sperm analysis ，CASA，北京穗加） 依据WHO《第四版人类精液检查和处理实验室手册》标准对精液进行分析，检测精子的运动参数，包括前向运动精子（a+b级）%，快速前向运动精子a%及VCL、VSL、VAP。

1.1 方法

1.2 分组：将精液标本与精子冷冻保护剂（Nidacon，澳大利亚）按3：1比例缓慢混匀，然后根据冷冻方法的不同分为2组：A组程序降温仪冷冻法，B组液氮熏蒸冷冻法。程序降温仪冷冻法使用的载体为0.5ml麦管（CBS，法国），内含冷冻精液体积为0.4ml;液氮熏蒸冷冻法根据使用不同的冷冻载体分为2组：B1组使用0.5ml麦管，B2组使用1.8ml冻存管（Thermo Scientific，美国），内含冷冻精液体积分别为0.4ml和1.2ml。

1.3 精子冷冻及复苏

1.3.1程序降温仪冷冻精液：将装有冷冻精液的0.5ml麦管放入程序化冷冻仪（Cl-8800i，澳大利亚）后，按照预设的降温曲线逐步降温，降温结束后投入液氮。降温曲线设定为：室温23℃降至5℃，1℃ /min，5℃停留5分钟，之后4℃降至-10.0℃，4℃ /min ，-10.0℃停留2分钟，之后-6.0℃降至-80℃，6.0℃ /min，投入液氮。

1.3.2液氮熏蒸法冷冻精液：将装有冷冻精液的0.5ml麦管和1.8ml冻存管按以下的步骤进行冷冻：液氮面上方15cm 处停留15分钟，之后在液氮面上方5cm 处停留5分钟 ，最后浸入液氮中。

1.3.3精液复苏及计数：

1.3.3.1 0.5ml麦管的复苏：从液氮罐中取出冷冻载杆，擦掉外表面的霜，置于37℃恒温水浴箱中1分钟。擦干麦管，剪开封口，用注射器吹出载杆中精液至离心管中，避免产生气泡。混匀后用定量移液器吸取10μl精液标本置于makler精子计数板上，使用CASASSA-Ⅱ型计算机自动检测分析系统依据WHO《第四版人类精液检查和处理实验室手册》标准对精液进行分析。每次分析至少200条以上的精子，重复2次，检测精子运动参数：前向运动精子（a+b级）%，快速前向运动精子a%及VCL、VSL、VAP，并计算精子冷冻复苏率= 冷冻后（a+b级）%/冷冻前（a+b级）%×100%。

1.3.3.2 1.8ml冻存管的复苏： 将存有冷冻精子的1.8ml 冻存管从液氮中取出，擦去外表面的液氮，置于37℃水浴箱中孵育5分钟。复苏后的精液混匀后用定量移液器吸取10μl精液标本，置于makler精子计数板上，使用CASA对精液进行分析（同上）。

1.3.4 复苏精液上游处理：为保证A组和B复苏精液的总体积相同以减少组间差异，0.5ml冷冻麦管需复苏3管，1.8ml冷冻管复苏1管，使两组复苏的精液总体积一致。采用上游法处理精液：将培养液与复苏精液按照体积1：1混匀，500g 离心5分钟。弃上清，沿管壁缓慢加入0.3ml G-mops plus，盖紧管口，置于 37℃培养箱上游60分钟。上游结束后用巴斯吸管小心吸取上層液体。调整精子终浓度为10～15*106/ml，取10μl精液标本置于makler精子计数板上，使用CASA对精液进行分析。剩余精子盖紧后室温中放置24小时。24小时后，混匀精子标本，取10μl标本置于makler精子计数板上，使用CASA检测以下精子运动参数：（a+b级）%、a级精子%、以及VCL、VSL、VAP。

1.4 统计分析：本文所有数据用 SPSS 17.0 统计软件分析处理，计量资料以（x±s） 表示，组间均数比较用Friedman秩和检验，两两比较用Wilcoxon秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 两组复苏后精子参数对比

程序降温仪冷冻法（A组）和液氮熏蒸法（B组）两组精液复苏后的参数如表一，两种冷冻方法以及使用不同冷冻载体冷冻精子的复苏率、复苏后（a+b级）精子百分率、a级精子百分率、VCL、VSL、VAP参数差异均无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 经上游处理24小时后精子参数对比

两种冷冻方法以及使用不同冷冻载体冷冻精子复苏后经上游法处理，24小时后（a+b级）精子百分率、a级精子百分率、VCL、VSL、VAP参数差异均无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

人类精子在冷冻过程中不可避免地会受到一些物理和化学效应的影响，原因就在于降温过程中产生的冰晶带来的机械损伤及高渗透性带来的化学损伤。不过，人类精子能够耐受一定范围内的冷冻伤害，这可能与精子膜上磷脂、糖脂及固醇含量有关，而且因为精子内水分含量较少（ 约为50%） ，精子比其它细胞更能耐受低温导致的损伤【3】。

精子冷冻较常使用的是程序降温仪冷冻法和液氮蒸汽熏蒸法。使用程序降温法冷冻精子需要事先对程序降温仪设定降温曲线。最开始的时候降温平缓，使精子逐步适应低温环境，可减少冷休克的发生，然后相对快速的降温，使得细胞外液渗透压升高，水分从渗透壓低的内液通过细胞膜流向渗透压高的外液，于是精子细胞自身皱缩，逐渐完成脱水的过程，从而减少精子内冰晶的发生。使用程序降温仪冷冻精子控温精确，是WHO推荐的精子冷冻方法[4]，缺点是需要专用程序化降温仪设备，耗时较长，部分冷冻仪还受到冷冻载体的限制，无法大规模冷冻精液。而液氮熏蒸法比较简单快捷，一次可以冷冻多管精液，如果测量液面高度统一，在几个温控的关键点降温都比较合理，人为操作培训得力，也是可以获得稳定、重复性好的结果。

无论使用哪种方法，复苏后的精子都有一定的死亡比例。刘勇等认为熏蒸法解冻后精子活力及复苏率得到显著提高[5]，而李玉山等认为两者复苏效果没有显著差异，均可在人类精子冷冻获得良好效果[6-7]。本研究的结果表明两种冷冻方法解冻后的精子存活率及运动能力都没有显著差异，都获得了较好的复苏效果。不过，熏蒸法在缓慢降温和快速降温两个阶段的温控仍然不及程序冷冻仪降温过程中的精细，因此液氮熏蒸法仍需进一步完善实验细节。

精子的前向运动率以及VCL、VSL、VAP等运动参数作为反应精子活力的有效指标，对男性不育的诊断和生育能力的评估具有一定的临床意义[8]。精子是否较长时间维持快速有力的运动能力对后续的受精有着重要的意义，因此，本文比较24小时后程序降温组和液氮熏蒸组复苏精子活力的差异意在进一步评估冷冻对两组精子活力的差异，结果显示液氮熏蒸法在复苏精子上游处理24小时后仍维持了较好的运动能力，同程序冷冻法比较差异是不显著的，进一步说明熏蒸法冷冻复苏后的精子也可以获得较好的效果。当然，在人类精子冷冻原理和冷冻损伤领域，还需要更深入的研究以期得到更好、更稳定的精子冷冻方法。

参考文献：

[1]Watson PF. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawingfunction.Reprod，. Fertil Dev，1995，7（4）： 871-891.

[2]范立青、朱文兵、肖红梅等。解冻后活动精子总数对他精人工授精妊娠率的影响研究[J]。《中国医师杂志》2001年3卷9期 572-573，578页

[3]熊承良，商学军，刘继红主编. 人类精子学. 北京： 人民卫生出版社，2013. 613-624.

[4]World Health Organization.WHO laboratory manual for theexamination and processing of human semen.5th ed.Geneva：WHO，2010.

[5] 刘勇，肖玉芳，赵东，施文博，卢慧，王如瑶，胡洪亮，李铮。人类精液一步熏蒸法冻融的实验研究。中华男科学杂志 2012 年3 月 第18 卷 第3 期

[6] 李玉山，王全先，高学敏，等. 程序冷冻法、液氮熏蒸法冷冻人类精子的效果比较. 中国卫生检验杂志，2008，18 （ 9） ：1814-1815.

[7] 刘睿智，孙妍，许宗革，等. 速冻和缓慢冷冻法对精子运动特征的影响. 中国男科学杂志，2006，20（ 1） ： 8-10.

[8] 屈宗银. 精子活力与精子运动参数关系的研究. 检验医学与临床，2009，6（23）： 1995-1996.

作者简介：何红梅（1978-），女，云南曲靖人，副主任医师，从事辅助生殖临床和科研工作

通讯作者：王艳玲，E-mail： wangnancy2013@163.com

基金项目：云南省生殖妇产疾病临床医学中心（zx2019-01-01）;云南省生殖妇产疾病临床医学中心开放课题（2019LCZXKF-SZ06）