抗体偶联药物的质量研究与质量控制

花海清

摘要：抗体药物偶联物 （ADC） 是一种新型的抗癌药物，随着技术迭代更新，这类药物在近几年引起了人们的关注。 ADC 将单克隆抗体的选择性与化疗药物的细胞杀伤特性（有效载荷）相结合，并通过适当的连接子连接在一起。抗体部分靶向肿瘤细胞和/或肿瘤微环境细胞表达的特定细胞表面抗原，充当在肿瘤组织内递送细胞毒性有效载荷的载体。盡管ADC药物在选择性和效力方面具有优势，但此类药物的研发仍充满挑战，其中质量研究和质量控制是研发的难点之一。本文结合笔者工作中的实际经验，论述抗体偶联药物及其质量研究与质量控制相关内容，为新型ADC药物的研发提供支持。ADC药物分为细胞毒性药物，连接子和抗体三个部分，是高级结构复杂的大分子药物。笔者分别分析和阐述了细胞毒性药物，连接子和抗体在生产过程中需要重点关注的质量研究内容和质量控制方法。在此基础上，笔者进一步阐述了ADC药物作为整体，对其质量研究需要采用的方法和完成的内容，包括结构分析，杂质分析和生物活性分析等。希望本文能为生物制药行业中研究和生产ADC药物的从业者带来一定的参考。

关键词：抗体偶联药物;质量研究;质量控制

【中图分类号】 R97 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）09--03

引言

抗体偶联药物（ADC）属于近些年来应用比较多的一种肿瘤治疗模式。ADC药物由单克隆抗体通过小分子连接子与高活性的小分子化合物偶联而成，兼具了抗体药物的高靶向性和小分子化合物的高活性的特点，有优异的临床效果和广阔的市场前景，表1总结了已获批的ADC药物。每个具体的ADC药物产品都有其独特的设计和生产方式，因此对于每个ADC产品的质量研究和质量控制措施需要根据其存在具有差异性的内容，应该做到针对性的分析。

1. ADC药物的结构特征

1.1 细胞毒性药物

细胞毒性药物的通常通过DNA 损伤、微管抑制、细胞周期抑制、RNA转录抑制等作用进行杀伤肿瘤细胞。相较于传统毒性药物而言，喜树碱类的小分子化合物，活性适中，体内毒性相对温和。喜树碱及其衍生物是拓扑异构酶I抑制剂，它们稳定了拓扑异构酶诱导的DNA单链断裂，当三元DNA-TOP1-抑制剂复合物遇到复制叉时，DNA发生双链断裂，促使肿瘤细胞死亡。此类分子具有较高的选择性和成药性，是能够当作ADC药物的药效成分进行开发的[1]。

1.2 连接子

连接子（即，连接药物与抗体的 ADC 区）在正确的 ADC 递送中发挥着重要作用。事实上，理想的连接子应使 ADC 在血液中保持稳定，确保免疫偶联物可以完整地到达肿瘤组织，但在偶联物内化至癌细胞后，连接子应能轻松断裂，以释放细胞毒性药物。 连接子产生的应用价值，就是确保ADC药物分子具有正常的结构和稳定性，使得药物在体液内循环期间是稳定的状态。当ADC药物经过抗体的特异性结合内化至肿瘤细胞中，通过溶酶体中的低pH值，或者蛋白酶解等过程，将药物进行释放出，从而发挥毒性作用，进而将肿瘤细胞进行消灭。药物分子上的细胞毒性药物，具备较强的疏水性特点，所以可以按照肿瘤的异质性，采取合适亲水性的连接子，促使疗效更好的提升。很多的ADC 药物属于依赖内化后释放药物，结果特殊设计的连接子，能够通过特定的反应（如低pH值或者蛋白酶）裂解，将小分子药物释放。

1.3 单抗分子

单抗分子属于一种多结构域的生物大分子，对其选择期间，应该先选择其合适的靶点。ADC 的单抗分子部分通常会与肿瘤细胞或肿瘤微环境细胞组分表面表达的靶抗原结合。ADC在结合靶抗原之后，会通过内化作用进入细胞内部，携带有负载的抗体分子到达溶酶体后，产生裂解反应，把细胞毒性药物进行释放。通常情况下，最优的靶点就是在肿瘤组织高表达或者是在特异性表达靶点上。研究指出，如果单抗分子具有越高的肿瘤穿透能力，那么其更适合用于合成ADC药物[2]。小分子药物通过连接子，与单抗分子上的赖氨酸残基或半胱氨酸残基进行反应后，共价连接到抗体分子上。偶联药物抗体比率（DAR）是ADC药物的重要属性，而且并不是具有越大的载药量，ADC的治疗效果就越好。过高的载药量会引发ADC药物的聚集，同时使得体内ADC药物过快的清除，从而削弱药效。

2. ADC药物的理化分析方法

2.1 ADC药物的结构与质量的相关性分析

如图1所示，由于ADC药物的复杂性，对ADC药物的质量研究需要对其结构特性进行全面分析。首先需要应用采用适当的、高精度的分析技术，从理化性质等角度对ADC药物进行全面细致的分析;其次，应结合对裸抗的特性分析充分了解偶联前后的相关特性变化;再次，尽可能详细的研究ADC药物的质量属性后，需要确定ADC药物的关键质量属性，为制品质量标准的建立提供依据。对于ADC药物结构进行解析过程中，应该有对照的物品。单克隆抗体具有复杂的结构和相当程度的异质性（如糖基化和不同形式的翻译后修饰等）。单抗本身的异质性叠加偶联过程可能会产生的变异性，进一步增加了ADC药物结构的复杂性。对于具有高度复杂异质性的ADC，需采用具有足够分辨率的可靠分析方法进行全面分析，分析内容包括小分子药物和连接子的化学性质、偶联方式（氨基偶联、巯基偶联、定点偶联等）。

注：达到临床研究阶段的实验性 ADC 可能具有与已获批 ADC 相同的靶抗原（此类抗原在绿框中以粗体表示），或可识别通常在实体瘤表达的新型肿瘤相关抗原 （TME）（此类抗原在绿框中不以粗体表示）或由肿瘤微环境中存在的免疫/基质细胞表达的新型肿瘤相关抗原 （TME）（紫色框）。这些 ADC 中的少数药物靶向新出现的细胞谱系特异性抗原（这些抗原由某些恶性血液病选择性表达）。与已获批的 ADC 一样，通过酸敏感、不可裂解或可裂解连接子将 mAb 部分连接到具有细胞毒性的有效载荷上。在大多数情况下，试验用 ADC 递送的细胞毒性化合物与已获批 ADC 所递送的化合物的不同（常见有效载荷列在粉色框中;新型有效载荷列在红色框中）。试验用 ADC 的 mAb 成分包括嵌合、人源化或全人源化 IgG1、IgG2 或 IgG4（也存在于已获批 ADC 中的常见 IgG 亚类以粗体表示）。

2.2 ADC药物一级结构和高级结构的理化分析方法

由于ADC药物的创新性和复杂性，其质量研究是一个系统性的工程，主要研究内容可以参考《抗体偶联药物质量控制和临床前评价专家共识》[3]。ADC的理化性质分析首先分析和评价偶联工艺对抗体一级结构的影响，可以采用肽图谱法和质谱等分析方法，评估偶联工艺对抗体一级结构的影响，重点需要关注偶联后的氨基酸序列与单抗序列的一致性，偶联后的二硫键连接形式及其与单抗的區别，同时可以进一步分析糖基化修饰的变化和翻译后修饰的变化等。偶联过程能够在一定程度上影响到抗体分子的一级结构，因此结构表征需要涉及到翻译后修饰。药物抗体偶联比（DAR）表示每个抗体分子上偶联的小分子药物的平均数量，它是ADC重要的质量属性之一，与ADC药物的安全性和有效性都有很强的相关性。检测DAR值的分析方法需要根据小分子药物的化学性质和ADC药物整体的理化性质确定。常用方法有：紫外分光光度法、反相色谱法、疏水色谱法和质谱法（MS）。紫外可见光谱是一种简单和最常用的DAR测定方法，该方法的先决条件是：1）药物应含有紫外线吸收基团;2）药物和抗体在紫外线可见光谱中表现出明显独立的最大吸收峰;3）药物的存在不应影响ADC样本中抗体的光吸收特性，反之亦然。根据测量到的吸光率和消光系数，可以根据Beer–Lambert原理计算出蛋白质和药物的浓度，依此计算平均DAR，公式如下：

质谱法（MS）是另外一种常用的分析DAR的方法。目前使用包括电喷雾电离质谱（ESI）、飞行时间质谱（TOF）或Orbitrap，以区分ADC的异质分子种类。根据质谱测定的分子量及相应峰面积等，使用以下公式计算平均DAR。

此外，还可利用质谱法对ADC药物中的偶联位点进行表征。 有时候，翻译后修饰对于偶联位点的表征会产生干扰，可通过脱糖、胰蛋白水解及还原烷基化等举措，减少干扰，保障检测的精准度。当小分子药物通过半胱氨酸残基偶联至抗体的情况下，还需要对二硫键的配对、游离巯基的数量以及巯基氧化等内容进行研究。为进一步研究ADC药物的高级结构，可采用圆二色谱、差示扫描量热等物理学分析方法。ADC的分子大小变异体是体现ADC药物纯度的重要指标，关系到ADC产品的安全性，可通过分子排阻色谱法（SEC-HPLC）重点分析ADC药物的聚体，通过非还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（NR-SDS-PAGE）和还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（R-SDS-PAGE）或者非还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺毛细管凝胶电泳（NR-CE-SDS）和还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺毛细管凝胶电泳（R-CE-SDS）ADC药物的片段。另外，需要重点研究ADC药物的稳定性以及生物学活性[4]。

3. ADC生产过程中产生杂质的控制方法

3.1 产品相关杂质的控制方法

由于ADC药物结构的复杂性以及生产工艺的繁琐，使其与传统的单抗类药物相比有更加特殊的杂质。ADC药物生产过程中产生的杂质主要分为产品相关杂质和工艺相关杂质。其中产品相关杂质主要是游离的小分子毒素。而游离的小分子毒素与产品的安全性息息相关，为保证产品的生物安全性，需要重点关注。ADC药物中的游离小分子毒素主要通过纯化等方式去除，因此需要关注纯化和超滤工艺及清洗验证等步骤的效果。对生产工艺中的纯化和超滤过程中的关键步骤加以控制，尤其是会影响游离小分子药物的去除效果的步骤。可以考虑对关键工艺步骤设置中控检测（如药物抗体偶联比和纯度等）。另外，对于其他的产品相关杂质，如产品的裸抗及其降解产物、连接子及其衍生物等相关杂质，需要遵循工艺、毒理数据、稳定性等，科学的对残留限度进行设定。对于裸抗的去除，可以考虑通过离子交换层析等手段，根据ADC药物和裸抗的表面电荷分布的差异，实现去除未偶联的裸抗。

3.2 工艺相关杂质的控制方法

ADC药物中的另一大类杂质是工艺相关杂质。其中最主要的是残留的有机溶剂。因此，偶联反应需要严格的遵循工艺流程，对于控制溶剂残留的关键步骤，在相关的原液、成品中应该重点关注。对于生产过程中使用的材料和设备，尤其是直接接触偶联反应溶液的部分，需要耐受有机溶剂，应对其可能的浸出物进行分析。运用的连接子具备亲水性，能够减少有机溶剂的运用，或者能够避免运用，由此实现了蛋白聚集的减少，而且可以将治疗指数提升。ADC的生产工艺的设计和控制需考虑可重现性和一致性，通过对关键工艺参数的控制（如投料比例、反应体积、反应温度、反应时间等），保证原液和成品的质量的批间一致性，同时需要保证工艺相关杂质和产品相关杂质始终处于可控的区间。

4. ADC药物生物学活性的研究

研究期间，可根据ADC药物的作用机制，设计科学合理的生物学活性检测方法。选用合适的阳性细胞株构建相应的细胞毒性杀伤模型，进行验证，在产品原液和成品批次检验等中进行运用。对于单抗部分的生物学活性，可通过抗体与抗原的结合活性进行表征和批次检验。对于生物活性的分析，通常采用四参数 Logistic 回归模型，计算药物剂量与活性之间的关系。该模型中有四个参数，分别是：Top 是指最大响应; Bottom 是指基线响应;Hill Slope 是指曲线的坡度。 EC50 是最大有效浓度的一半。通采用回归拟合后计算得到的EC50值，或者Top值来表征ADC药物的生物学活性。四参数 Logistic 方程有如下两种形式：

1）一种是浓度 X 已经用以 10 为底的对数做了变换的形式，其计算公式如下：

Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+10^（（LogEC50-X）*HillSlope））

2）一种是 X 没有变换过，其计算公式如下：

Y=Bottom + （X^Hillslope）*（Top-Bottom）/（X^HillSlope + EC50^HillSlope）

对于任何一种方式，参数估计值、标准误和置信区间都是相同的。

5. 结论与建议

ADC药物具有非常复杂性的工艺，所以应该重点进行控制生产用原材料、工艺流程设计、过程控制、稳定性研究、工艺验证等方面。按照临床应用的剂量、应用的方式，在ADC 药物的原液和制剂的质量标准中进行增添常规检项。DAR值紧密的关联于药物安全有效性，可以采取紫外分光光度法、反相色谱法、疏水色谱法和质谱法（MS）等进行检验。检测完整ADC药物分子，可采取小分子药物特异性抗体和抗体的靶标分子实施检测。部分关键质量属性检项，诸如纯度和电荷异质性等，落实互补的多种检定技术。进行评价ADC药物的异常毒性过程中，应该密切的考虑到产品急性毒性试验结果，进行给药剂量的科学规定。

综上所述，在ADC的质量研究和质量控制方面，应该综合考虑其产品特性、产品工艺等。开发药物期间，变更是会产生的情况，所以质量研究、质量控制中，需要在产品的研发阶段落实，对毒理、临床、商业化生产批次之间的可比性进行分析考虑。未来期待产生更多样化的具备创新作用机制的 ADC药物，给患者临床治疗提供更好的福音。

参考文献：

[1]王宗凯， 刘煜. 抗体偶联药物的有关进展[J]. 药物生物技术， 2011， 18（4）：5.

[2]黄佳，王浩，钟薇，陈岷. 抗体偶联药物戈沙妥组单抗在三阴性乳腺癌中的研究进展[J]. 中国医院药学杂志，2021，10（09）：1-5.

[3] 王兰，郭莎，于传飞，王文波，付志浩，霍艳，王欣，耿兴超，刘丽，文海若，陈琰，Christopher Yu，蔺亚萌，方言，房健民，姚雪静，李新芳，胡朝红，杨敬，Lise Loberg  . 抗体偶联药物质量控制和临床前评价专家共识 中国食品药品检定研究院

[4]齐连权，韦薇，常翠云，白玉，罗建辉. 抗体偶联药物及其质量研究与质量控制[J]. 中国新药杂志，2019，28（12）：1428-1432.

撰写日期：2022-04