NGF、TrkA及c-Met表达对原发性上皮性卵巢癌病情评估及预后预测的作用*

刘海龙 李娟 董小鑫 黄翠兰

(1.西安交通大学， 陕西 西安 710000；2.岳池县人民医院， 四川 广安 638300；3.西安交通大学医学院附属西安市第九医院， 陕西 西安 710000)

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其中原发性上皮性卵巢癌较为多见，占所有卵巢癌的90%左右[1]。早期卵巢癌患者无明显症状，多数患者就诊时已处于晚期，易错过最佳治疗时期，影响患者预后[2]。所以早期诊断卵巢癌，进一步评估病情进展，进而采取相应治疗措施是提高诊疗成功率的关键[3]。c-Met(c-metprotoncogene)是原癌基因，具有酪氨酸激酶活性，参与细胞信号转导、调控细胞骨架重建，已证实其表达水平与多种肿瘤发生发展密切相关[4]。神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)作为一种多效性肽类激素，可通过与靶细胞中亲和力较高的TrkA受体及低亲和力P75受体结合调控细胞正常生理活动，且NGF在多种恶性肿瘤中呈异常表达状态，与肿瘤进展、预后密切相关[5]。研究显示，c-Met和Trk受体除了在肿瘤发生和发展中各自的作用外，在促进肿瘤进展方面也有关系[6]。活化的c-Met增强TrkA信号传导和神经生长因子的生物活性[7]，TrkB上调肿瘤细胞中c-Met的表达，增强肿瘤细胞的侵袭力[8]。TrkA和c-Met的高表达和c-Met拷贝数增加/扩增是涎腺导管癌(Salivary duct carcinoma，SDC)中的常见事件，并且TrkA和c-Met的高表达揭示了在HER2阴性的SDC中与不良预后相关的趋势[9]。最近的分子研究表明，胶质母细胞瘤中的c-Met和Trk通路相互反式激活[10]。本研究用NGF、TrkA、c-Met的表达情况对原发性上皮性卵巢癌患者进行病情评估，并分析其在该病患者预后预测中的作用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析岳池县人民医院2016年6月～2018年6月收治的115例原发性上皮卵巢癌患者，年龄36～75岁，平均(50.31±6.65)岁。将卵巢癌患者作为癌组织组，将对侧正常卵巢组织作为正常组织组，每组各115例。纳入标准：①所有患者均经病理检查证实。②未接受化疗、放疗、免疫等辅助治疗。③本研究患者临床资料均完整。④无其它恶性疾病。⑤受试者签署知情同意书。排除标准：①合并肝、肾、心脏脏器严重疾病者。②合并严重神经功能、认知功能障碍者。③依从性差者。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法 收集所有患者临床资料，比较NGF、TrkA及c-Met在癌组织组及正常组织组的表达情况；分析NGF、TrkA及c-Met与原发性上皮性卵巢癌患者各病理参数的相关性，记录所有患者在随访时间内存活及死亡情况，采用多元Logistic回归分析影响原发性上皮卵巢癌患者预后生存的危险因素；采用ROC曲线分析NGF、TrkA及c-Met对原发性上皮卵巢癌患者生存预后的预测价值。

1.3 标本采集及检测方法 NGF、TrkA及c-Met：采用免疫组化法进行检测，NGF、TrkA单克隆抗体购于美国ABCAM公司，c-Met购于北京博奥森生物技术有限公司。免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶连接法(Streptavidin-perosidase，SP)法，SP试剂盒购自北京中山生物科技有限公司。各步骤均严格按照试剂盒说明书进行操作[11]。染色结果判定标准[12]：以细胞核中出现棕黄色颗粒为NGF、TrkA及c-Met阳性染色细胞。每张切片随机选取10个高倍视野，按照阳性细胞的染色数量和显色强度分级评分，取其平均值。细胞染色数量的评分按照阳性细胞计数占同类细胞的百分比，计算该病例的细胞阳性率。阳性细胞数<5%计0分；6%～25%计1分；26%～50%计2分；51%～75%计3分；>76%计4分。根据细胞染色强度加以评分，无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。染色强度和阳性范围得分相加，≥2分为阳性，其余为阴性。

1.4 随访方法 本研究随访从患者治疗开始，直至本研究结束，为期2年，截止于2020年6月；平均随访时间为(15.71±5.93)个月。对患者随访的方式主要采用电话随访、微信随访及患者来院复查为主。

2 结果

2.1 两组NGF、TrkA及c-Met的表达情况比较 癌组织组NGF、TrkA及c-Met阳性表达率显著高于正常组织组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

图1 NGF、TrkA及c-Met在原发性上皮卵巢癌的表达(500×)Figure 1 Expression of NGF，TrkA and c-Met in primary epithelial ovarian cancer注：A. NGF在原发性上皮卵巢癌组织表达；B. NGF在正常卵巢癌组织表达；C. TrkA在原发性上皮卵巢癌组织表达；D. TrkA在正常卵巢癌组织表达；E. c-Met在原发性上皮卵巢癌组织表达；F. c-Met在正常卵巢癌组织表达

2.2 NGF、TrkA及c-Met在原发性上皮卵巢癌患者的表达与临床病理特征 原发性上皮卵巢癌患者NGF、TrkA及c-Met表达与年龄、组织分化类型、腹腔积液无明显相关性(P>0.05)。而与淋巴结转移、临床分期、分化程度有相关性(P<0.05)。见表2。

表2 NGF、TrkA及c-Met在原发性上皮卵巢癌患者的表达与临床病理特征[n，n(×10-2)]Table 2 Expression of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer and their relationship with clinicopathological features

2.3 原发性上皮卵巢癌患者预后情况 经两年随访后显示，患者两年生存率为35.65%(41/115)。NGF表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为(32.75±1.82)个月、(20.35±1.01)个月；TrkA表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为(30.09±1.08)个月、(21.46±2.15)个月；c-Met表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为(32.27±2.08)个月、(18.93±1.04)个月。生存分析显示NGF、TrkA及c-Met表达阴性者生存期较长(P<0.05)。见图2～4。

图2 NGF表达与原发性上皮卵巢癌患者生存时间曲线图Figure 2 NGF expression and survival time curve of patients with primary epithelial ovarian cancer

图3 TrkA表达与原发性上皮卵巢癌患者生存时间曲线图Figure 3 The relationship between TrkA expression and survival time of patients with primary epithelial ovarian cancer

图4 c-Met表达与原发性上皮卵巢癌患者生存时间曲线图Figure 4 4 c-met expression and survival time curve of patients with primary epithelial ovarian cancer

2.4 影响原发性上皮卵巢癌患者预后生存的单因素和多因素分析 分化程度、临床分期、淋巴转移、NGF、TrkA及c-Met阳性是影响原发性上皮卵巢癌患者预后生存的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响原发性上皮卵巢癌患者预后生存的单因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with primary epithelial ovarian cancer

2.5 NGF、TrkA及c-Met对原发性上皮卵巢癌患者预后生存的预测价值 采用ROC曲线分析 NGF、TrkA、c-Met及三者联合对原发性上皮卵巢癌患者预后生存的预测价值，NGF、TrkA、c-Met及三者联合曲线下面积分别为0.780、0.851、0.808、0.946，各指标曲线下面积以联合检测最大，故联合检测的预测价值最佳，见表4、图5。

表4 NGF、TrkA及c-Met对原发性上皮卵巢癌患者预后生存的预测价值Table 4 Prognostic value of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer

图5 NGF、TrkA及c-Met对原发性上皮卵巢癌患者预后生存的预测价值Figure 5 Prognostic value of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer

3 讨论

近年来，由于原发性上皮卵巢癌早期缺乏特异性症状，临床病死率较高，患者生存预后总体较差，因此，如何提高早期原发性上皮卵巢癌筛查准确率越来越受重视[13-14]。

c-Met位于染色体7q21-31，由α及β链构成异二聚体，与HGF特异性结合诱导c-Met蛋白构想改变，催化底物蛋白，将信号向细胞核内传导，参与细胞新型转导及调控细胞骨架，使细胞黏附作用减弱，诱导新生血管生成，增强细胞外基质、金属蛋白酶表达水平，刺激恶性肿瘤细胞生长及转移[15-16]。相关研究发现，c-Met可增强肿瘤细胞基因型，使高表达水平肿瘤细胞与HGF结合，使肿瘤细胞敏感性及侵袭性增加[17-18]。目前，已有研究证实c-Met的过表达和基因扩增与肝癌、非小细胞癌、乳腺癌、食管癌等恶性肿瘤发生及转移密切相关[19-20]。相关学者采用定量PCR和免疫组织方法检测结肠癌组织及正常结肠组织c-Met表达的研究显示，c-Met在肠癌中的表达远远高于正常结肠粘膜[21]。本研究结果显示，在原发性上皮卵巢癌中c-Met阳性表达率显著高于正常组织，且随着临床分期增高、组织分化程度的增加及淋巴结的转移，c-Met阳性的高表达率也显著上升，与既往研究一致。考虑c-Met参与信号通路，可激活酪氨酸激酶，级联激活 P13K/Akt、Wnt/β-catenin以及MAPK信号多条信号通路，调节卵巢癌组织细胞的增殖、分化和侵袭[22-23]。

NGF是神经生长因子家族一员，通过与靶细胞表面的神经生长因子受体特异性结合介导发生生物学效应。研究发现，NGF不仅是神经及非神经细胞生长、分化、增殖等所需中重要物质；还可以通过旁分泌、自分泌作用促进肝细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞增殖、血管新生及浸润[24-26]。此外，相关国外研究发现，NGF可调节垂体卵泡刺激素的分泌及卵巢上皮表面FSH受体水平变化[27]。TrkA作为NGF受体之一，具有内在酪氨酸激酶活性，是NGF的功能性受体。研究表示，TrkA与NGF高亲和力结合，使解离速度变慢，促使TrkA结构发生磷酸化，激活相应生物学作用[28]。目前，相关众多研究表明TrkA在非神经来源的肿瘤发生过程中具有重要作用。Raychaudhuri等[29]在Hodgkin淋巴瘤细胞中发现，TrkA表达水平明显高于正常细胞，且使用酪氨酸阻滞剂处理后，可减少肿瘤细胞的存活率. 预示TrkA在将来可能是一种新型的肿瘤治疗方法。此外，也有研究提出TrkA活化在晚期浆液性卵巢肿瘤中常见，TrkA的表达水平与晚期浆液性卵巢肿瘤细胞呈正相关。类似的，相关研究予以应用阻断TrkA作用的酪氨酸寂寞受体阻断剂隔绝TrkA作用后发现，其对肿瘤细胞的生成可明显减少，且可诱导肿瘤细胞凋亡，考虑TrkA在分子靶向治疗中具有广阔应用前景[30-31]。而本研究显示，NGF、TrkA阳性与原发性上皮卵巢癌患者预后生存密切相关，说明NGF、TrkA表达水平对临床治疗及预后预测具有重要指导意义。此外，本研究为深入了解NGF、TrkA及c-Met与原发性上皮卵巢癌患者预后生存的预测价值，采用ROC曲线研究显示，NGF、TrkA及c-Met水平联合对原发性上皮卵巢癌患者预后生存预测价值最佳，说明检测NGF、TrkA及c-Met水平可作为预测患者预后的有效手段。

4 结论

综上所述，NGF、TrkA及c-Met与原发性上皮卵巢癌患者病情评估、预后预测密切相关，临床监测其水平对患者诊断治疗及预后预测具有重要作用，临床可根据该水平变化制定个体化治疗方案，以延长患者的生存期。本研究为单中心、回顾性研究，临床资料收集不全，使得研究受到一定的限制，后期将进一步扩大样本量或多中心合作研究予以进一步证实。