基于“新型微生物菌肥研发”培养学生创新能力

李亮 史硕 夏希成 王清昌 霍亚兵

摘  要：理论联系实际，设计一种关于制备微生物菌肥的创新方法。通过植物与微生物的有效联合，探索微生物对作物的促生效应，从而加深学生对分子生物学理论知识的理解。该课题通过锻炼学生对基本实验操作技术如DNA的提取，叶绿素含量测定的掌握以及精密仪器如PCR仪器，色谱仪，凝胶成像系统的使用，培养学生严谨扎实的科研作风;通过提出问题-分析问题-解决问题的教学手段，培养学生解决科学问题的逻辑思维能力。该项工作模式为培养具有创新精神和创新能力的新时代大学生奠定坚实的基础。

关键词：印度梨形孢;小麦;生物菌肥;发酵条件;促生效应

中图分类号：G642 文献标志码：A          文章编号：2096-000X（2022）13-0038-04

Abstract： An innovative method of preparing microbial fertilizer was designed by combining theory with practice. Through the effective combination of plants and microorganisms， promotion effect of microorganism on crop have been explored， which deepen students' understanding of the theoretical knowledge of molecular biology. By training students to master basic experimental operation techniques such as DNA extraction and chlorophyll content determination， as well as the use of precision instruments such as PCR instrument， chromatograph and gel imaging system， students' rigorous and solid style of scientific research were cultivated in this project. Through the teaching method of "question raising， problem analyzing and problem solving"， the logical thinking ability of students to solve scientific problems was cultivated. This work made a solid foundation for the cultivation of innovative spirit and innovative ability of college students in the new era.

Keywords： Piriformospora indica; wheat; biological fertilizer; fermentation conditions; promoting effect

科技创新能力是指通过科学知识的积累和创新性思维揭示客观事物的本质内在联系，并在此基础上产生新颖的、前所未有的思维成果，它是一种开创性的探索未知的心理活动，是人类智慧升华的表示[1]。当代大学生科技创新能力的培养是非常重要而且必要的。创新教育中，注重学生学习兴趣的激发、创新精神的培养、潜能的开发、个性的发展和实践能力的提高，对提高学生综合素质、增加学生就业机会具有重要意义。

大学生利用课余时间进行创新实验是培养大学生综合实验能力的良好时期。按照提出问题，分析问题，解决问题的思维方式，提出目前在农业化肥使用中存在的问题。通过文献检索发现：在过去的几十年中，传统化肥的使用极大地促进了农业的发展。但是研究表明，长期施用化肥对土壤养分、结构及生态与环境等方面均产生诸多不良影响， 甚至对人体健康产生严重危害[2]。专家指出，开发增产增收并且环保无污染的生物菌肥是发展生态农业、实施农业可持续发展策略的一项重要措施。但是现有生物肥料的菌种与寄主植物相对专一，菌种资源不多、数量偏少、作用也参差不齐，致使实际生产、推广难度大[3]。

本课题提出利用根际微生物与作物的共生关系，研发一种绿色、安全、无污染的促生型生物肥料，旨在减少因化肥造成的污染，改善土壤结构并弥补现有生物肥料作用寄主植物单一、肥效不稳定等缺陷。该实验所涉及到的微生物材料是内生真菌印度梨形孢（Piriformosporaindica）[4]，它可以与多种作物，例如玉米、番茄、大豆、水稻、高粱、小麦等[5-7]建立共生关系并能促进作物的生长及产量提高。

该实验的目的是基于菌肥的制备并探究微生物对作物的促生作用来促进大学生科技创新能力的开发与培养。通过该实验课程激发学生对科研的兴趣，掌握实验操作中常用仪器的使用和工作原理，学会实验方法的选择、原理和操作，以及试验资料的收集整理，实验数据的处理和对实验结果的分析归纳能力。通过该课题的研究，能有效地锻炼学生理論联系实践的能力，有利于提高学生的研究能力、综合能力和创新能力。

一、选题阶段

4个学生组成一个大学生创新创业计划团队，首先根据研发技术内容的关键词大量搜索文献，分析该领域存在的问题，针对问题提出解决方案并进行可行性分析，在此基础上撰写选题报告并与指导教师进行探讨，明确技术路线，并设计实验方案，整个过程由学生独立完成，指导教师最终审核，将实验课题定为“新型微生物菌肥研发”。

二、实验阶段

（一）实验材料与设备

CM固体培养基、CM培养液、羧甲基纤维素、1×PBS、滑石粉、盐酸、氢氧化钾、台盼蓝、 乳酸酚、琼脂糖、溴化乙锭、蛭石、珍珠岩、乙醇、次氯酸钠、甲烯蓝、DNA试剂盒、恒温震荡培养箱、无菌Buckner漏斗、尼龙布（400 nm）、荧光定量PCR仪、磁力搅拌器、离心机、Bio-rad凝胶电泳成像系统、显微镜、高温高压蒸汽灭菌锅等。

（二）实验步骤

1. 印度梨形孢发酵条件的优化

实验设置3个温度梯度组，分别为20℃、23℃和26℃，设置3个不同pH值梯度组，分别是6.0、7.0和7.5，取等量印度梨形孢接种到不同条件下的CM[8]液体培养基中生长，观察并统计生长情况。

2. 印度梨形孢菌肥的制备

印度梨形孢接种于CM固体培养基中，接种板在23℃的黑暗环境中放置30 d后，收集孢子，接种到培养液中，置于温度为23℃的恒温震荡培养箱中生长30 d。

用无菌Buckner漏斗和尼龙布（400 nm）过滤培养液中的印度梨形孢，用1×PBS洗涤;在培养液中加入羧甲基纤维素（CMC）和印度梨形孢;取CMC悬浮液[9]与无菌滑石粉均匀混合，即制得印度梨形孢菌肥。

3. 小麦种子萌发及实验室施肥

土壤灭菌后（蛭石∶珍珠岩=2∶1质量比），将菌肥与土壤分别以1∶1，1∶2，1∶3质量配比混合均匀，形成不同比例菌肥实验设置，以不施肥为空白对照。

将置于4℃冰箱中春化的小麦种子经乙醇、次氯酸钠溶液无菌处理后，将种子置于土壤中。

4. 印度梨形孢定殖小麦根形态学观察及真菌18S rDNA扩增鉴定。

施加菌肥3 d后，随机选取小麦幼苗根系，经台盼蓝[10]溶液过夜染色后，于显微镜下观察印度梨形孢定殖情况。

另选取小麦根系，使用DNA试剂盒提取DNA，经PCR[11]扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，利用Image Lab 3.0软件进行分析。

5. 小麦促生效应检测

待小麦发芽后，统计发芽种子数，计算发芽率，在播种后第7天统计小麦根长、株高;使用乙醇研磨法[12]测得小麦叶绿素含量;使用浸泡法[13]测得小麦电导率，并计算相对电导率;使用甲烯蓝比色法[14]测得吸光度，并计算根系的活跃吸收面积比，作为根系活力指标。

（三）结果与分析

1. 发酵条件分析

如图1所示，在温度为23℃，pH值为7.0条件下印度梨形孢生物量显著高于对照，其菌丝致密，孢子浓度大，对照组产生的菌丝透明且稀疏。通过温度和pH的梯度实验，明确印度梨形孢最适生长温度为23℃，pH值为7.0。

2. 印度梨形孢共生小麦根形态学观察及真菌18S rDNA扩增鉴定

在40×10显微镜下可清晰地观察到该真菌在植物根部定殖有椭圆形的厚垣孢子，如图2（a）箭头所示。以提取的DNA为模板，用引物ITS进行PCR扩增，用扩增的rDNA、ITS进行琼脂糖凝胶电泳。电泳图谱显示扩增出的片段大约200 bp （图2b），可确定有真菌定殖于小麦根部。

3. 小麦促生效应检测

小麦发芽率和生长参数统计：为了明确印度梨形孢对小麦的促生作用，对小麦发芽率和株高进行了生物学统计。如图3所示，印度梨形孢对小麦植株的生长有显著性影响，小麦种子种植在不同比例拌菌土壤中，施有菌肥小麦的发芽率、株高均优于对照，且拌菌比例越高促生效果越明显。

相对电导率的测定：当植物受到不良环境因素时，能伤害原生质的结构而引起透性改变，细胞内含物外渗，电导率增大;电导率越大，植物受伤愈重，抗性愈弱，反之抗逆能力越强。在生物胁迫方面，印度梨形孢可以诱导植物产生系统抗性，如图4（a）所示，拌菌比例为1∶1、1∶2、1∶3的实验组相较于对照，相对电导率均大幅度降低，小麦的抗逆性增强，这有力地说明了印度梨形孢可以诱导植物自身防御机制增强，提高抗逆能力。

叶绿素含量的测定：叶绿素是植物叶片进行光合作用的主要色素，其含量高底在一定程度上反映了植物的光合作用水平。从图4（b）可以看出，小麦叶片中的叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量均随着拌菌比例的提高而增加，与对照相比，有明显差异。由此得出结论，印度梨形孢定殖小麦可通过增强叶片的光合作用增加有机物的积累。

根系活力的测定：植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部分的营养状况及产量水平，根系活力就是一个表征植物根系的量，这里以根系的活跃吸收面积百分比作为指标。印度梨形孢定殖到作物根部，促使了那些不溶的和凝聚的或者复杂形式的氮、磷的流动，使寄主植物最大限度的运用到土壤中已存在的氮、磷元素，提高根系活力。如图4（c）所示，拌菌比例为1∶1、1∶2的实验组根系活力较高，而对照组的根系活力最差。这与不同拌菌比例小麦的生长参数和理化性质表现相一致。

（四）实验小结

通过“新型微生物菌肥研发”实验，在教师的指导下，学生独立规划和进行实验，熟练掌握了无菌操作的步骤以及显微镜、荧光定量PCR仪、离心机等精密仪器的使用，学会了使用office、origin等软件进行数据处理，也锻炼了学生们探索规划、开拓创新的能力。但由于实验周期过短，学生课余时间不够丰裕，导致对本实验探究不夠深入，具体的实验结果还需要进行进一步实验验证。

三、结束语

学生科技创新实验是服务新时期高校素质教育的需要，在实验过程中，学生的创新意识和实践能力显著提高，学会将专业基础理论知识灵活运用到实验规划及操作中，逐渐具备主动学习、主动思考以及主动创新的能力，并清楚认识到合作精神是团队有序运作、实验有序进行的关键。在教师指导下，学生通过“自主查阅文献-选题-确定实验方案-进行实验-不断摸索、改进创新-得出实验结论”的流程，提高了科学实践、科技创新的能力。

参考文献：

[1]姬广敏.青少年科技创新能力的结构构建与培养研究[D].济南：山东师范大学，2015.

[2]汪生新.浅谈化肥过量施用的危害及防治措施[J].青海农林科技，2018（2）：34-35.

[3]范丙全.我国生物肥料研究与应用进展[J].植物营养与肥料学报，2017，23（6）：1602-1613.

[4]楼兵干，孙超，蔡大广.印度梨形孢的多种功能及其应用前景[J].植物保护学报，2007，34（6）：653-656.

[5]王慧俐.印度梨形孢发酵液对番茄种子萌发和幼苗生长的影响[J].浙江农业科学，2019，60（6）：883-886.

[6]Oelmüller R， Sherameti I， Tripathi S， et al. Piriformospora indica， a cultivable root endophyte with multiple biotechnological applicatioons[J]. Symbiosis， 2009（49）：1-17.

[7]于秋鹏，符世雄，胡生会，等.印度梨形孢对威芋5号脱毒马铃薯产量及品质的影响[J].农业技术与装备，2020（7）：17-20.

[8]Shahollari B， Giong P H， Hehl S， et al. Association of Piriformospora indica， with Arabidopsis thaliana， roots represents a novel system to study beneficial plant-microbe interactions and involves early plant protein modifications in the endoplasmic reticulum and at the plasma membrane[J]. Physiologia Plantarum， 2004，122（4）：465-477.

[9]Chadha N， Mishra M， Bandyopadhyay P， et al. Protocol for production of the beneficial fungus Piriformospora indica for field applications[J]. Journal of Endocytobiosis and Cell Research， 2014（25）：42-46.

[10]支添添，周舟，韓成云，等.台盼蓝染色鉴定拟南芥sdl1突变体的细胞死亡[J].作物研究，2013，27（3）：217-218.

[11]张玲秀，白建华，郝瑞林，等.印度梨形孢发酵条件优化及玉米田间应用试验[J].江苏农业科学，2018，46（24）：334-337.

[12]李志丹，韩瑞宏，廖桂兰，等.植物叶片中叶绿素提取方法的比较研究[J].广东第二师范学院学报，2011，31（3）：80-83.

[13]陈爱葵，韩瑞宏，李东洋，等.植物叶片相对电导率测定方法比较研究[J].广东教育学院学报，2010，30（5）：88-91.

[14]宋海星，王学立.玉米根系活力及吸收面积的空间分布变化[J].西北农业学报，2005（1）：137-141.