花生四烯酸诱导建立大鼠弥漫性脑血栓模型

宁 珑, 孙 航, 冯 晋, 孟庆婷, 杨 茜, 何芳雁

(云南中医药大学中药学院,昆明 650000)

缺血性脑卒中（ischemic stroke）是我国脑血管疾病中发病率最高的病种。虽然在时间窗内（＜4.5 h）使用组织纤维溶酶原激活物（tissue-plasminogen activator，t-PA）溶栓可改善大部分缺血性脑卒中患者的预后［1］，但会增加患者出血转化（hemorrhagic transformation）的风险；如超时间窗使用，其风险将增加10倍，死亡率提高10%～40%［2］。由于缺血性脑卒中临床病情复杂，临床前研究需根据病因、缺血时间及损伤程度等选择适合的缺血性脑卒中模型，同时还须考虑模型的稳定性、可靠性、易行性、经济性等特征。临床弥漫性脑血栓是造成缺血性脑卒中的主要原因之一。

1988 年Cahn 等［3］利用花生四烯酸（arachidonic acid）诱导血小板活化与聚集、血管内皮损伤，其在体内可代谢为血栓素A2、白三烯等多种产物，使血栓素A2与前列腺素I2的比例失衡，促使血小板聚集、血管收缩，形成脑血栓；并且在花生四烯酸引起的脑血栓损伤后几分钟内即可发生血管源性脑水肿和血脑屏障损伤［4］。因此，通过该方法可以建立操作简单、手术时间短、对实验动物创伤程度低的大鼠弥漫性脑血栓模型。然而由于当时的操作细节不够完善，例如手术切口不合理、未规定花生四烯酸的保存方式、麻醉药物选用不合适等原因，该模型复制的稳定性差、死亡率高，限制了推广应用。

本实验总结了通过颈内动脉注射花生四烯酸建立大鼠弥漫性脑血栓模型的操作要点，完善操作细节，并以脑组织伊文思蓝（Evans blue，EB）渗出含量及缺血病理损伤程度为依据，对模型的成功率及稳定性进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4～8 周龄的SPF 级雄性SD 大鼠24 只，体质量为250～300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供［SCXK （湘） 2019-0004］，质量合格证号为430727210100499718。动物饲养于云南中医药大学动物实验室［SYXK（滇）K2017-0005］，饲养室温度为20～25 ℃，相对湿度为50%～65%，日光灯照明12 h，自由进食与饮水。动物实验方案经本单位实验动物伦理委员会审批通过（编号R-062019LH001）。

1.2 药物与试剂

花生四烯酸（批号XKN3C-JG）购自东京化成工业株式会社；阿托品（批号130404）购自上海禾丰制药有限公司；多聚甲醛（批号20100525）购自天津化学试剂研究所；异氟烷（批号217180101）购自深圳市瑞沃德生命科技与限公司；肝素钠注射液（批号151607006A）购自常州千红生化制药股份有限公司；EB（批号L04D11J133367）购自上海源叶生物科技有限公司；苏木精（批号1612154094）、伊红（批号1612154094）均购自福州迈新生物技术开发有限公司；盐酸（批号20081215）购自成都市科龙化工试剂厂；中性树胶（批号20150202）购自上海标本模型厂。

1.3 主要仪器

石蜡包埋机（型号HISTOSTATS）和石蜡切片机（型号Microm HM）为赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；显微镜（型号Nikon DS-U3）为日本NIKON公司产品；数字式超级恒温浴槽（型号IISS-1B）为成都仪器厂产品；烘箱（型号DHG-9140A）为上海慧泰仪器制造有限公司产品；电子分析天平（型号AB204-S）为瑞士Mettler Toledo公司产品；小动物麻醉机（型号V1824301）为美国Marex公司产品。

1.4 花生四烯酸的配制及保持方法

向规格为50 mg/支的花生四烯酸中加入10 mL 浓度为100 mmol/L 的Na2CO3，分装后冲氮气密封保存于－80 ℃冰箱备用；使用前用生理盐水（即0.9%NaCl溶液）将花生四烯酸稀释到质量浓度为0.5 g/L，现用现配。

1.5 大鼠弥漫性脑血栓模型复制

将大鼠随机分为假手术组和模型组，每组12 只（一半用于EB 染色，一半用于HE 染色）。用异氟烷吸入麻醉，并肌内注射治疗剂量的阿托品。使右侧颈部皮下筋膜暴露，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉，并结扎颈外动脉分支和颈总动脉近心端，在其远心端用动脉夹夹紧，显微剪在颈总动脉游离端剪一个小口，插入导管，去除动脉夹。将0.5 mg/kg花生四烯酸（0.1 mL/100 g 体质量）经导管（使用前先经肝素-生理盐水抗凝处理）注入颈总动脉，后结扎远心端动脉，进行缝合。实验过程中使大鼠仰卧于加热垫上，保持肛温恒定在37 ℃［3，5］。假手术组钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉后即可进行缝合，不注入任何药物。

1.6 脑组织中EB含量测定

注入花生四烯酸后5 min 立即注入0.2%（0.5 mL/100 g 体质量）EB，再过5 min 后立即用手术剪断头处死动物，开颅取出大脑，脑组织沿脑桥上界面切断，去除嗅球。按图1所示，在脑前极与视交叉连线中点、视交叉处、漏斗柄处以及漏斗柄与后叶尾极之间冠状方向将脑分为5 块组织。拍照后将脑组织放入匀浆器中，加入5 mL 0.5% Na2SO4及丙酮（3∶7）混合液制成匀浆液，试管密封静置60 min 以上；经3 000 r/min离心10 min，取上清液在620 nm波长处测定吸光度值。以栓塞侧的吸光度值与脑质量之比表示EB的含量，反映脑血栓的严重程度。

图1 大鼠弥漫性脑血栓模型的脑组织冠状切块示意图Figure 1 Coronal slices of brain tissue in rats with diffuse cerebral thrombosis

1.7 HE染色观察脑组织病理改变

按1.6 节方法取脑、切块后，4%多聚甲醛溶液固定过夜。次日将第2、3、4片脑组织放入镂空铝盒中，以流动的水浸泡2 h 以上，依次经过梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明、浸泡石蜡，然后进行组织包埋及切片。石蜡切片在59～62 ℃烤箱内烘烤20 min后，进行常规脱蜡复水，依次为二甲苯1、二甲苯2、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇溶液、90%乙醇溶液、80%乙醇溶液、70%乙醇溶液、自来水浸泡5 min。复水后的脑组织经苏木精染色5 min，用流动水冲洗10 min后，1%盐酸乙醇溶液分化。再用流动的水冲洗10 min，使用伊红染色25～35 s，梯度乙醇溶液脱水后中性树胶封固。最后用光学显微镜观察，并拍照。

1.8 统计分析

采用SPSS 26软件进行数据统计分析。结果数据均用xˉ±s表示，组间比较采用独立样本均数t检验。以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 弥漫性脑血栓模型大鼠脑组织渗出EB 含量增多

建模过程中两组大鼠均未见死亡。与假手术组大鼠的脑组织中EB 含量（0.16±0.03 μg/g）比较，经花生四烯酸经颈内动脉注射建立的弥漫性脑血栓模型组 大鼠缺血侧的EB 含量（0.25±0.10 μg/g）明显升高，差异有统计学意义（n=6，P＜0.01）。两组大鼠脑组织经EB染色后的拍照结果见图2。

图2 弥漫性脑血栓模型大鼠脑组织的依文思蓝染色结果Figure 2 Evans blue（EB）staining images of brain tissue in rats with diffuse cerebral thrombosis

2.2 弥漫性脑血栓模型大鼠脑组织病理学变化

HE染色结果显示，假手术组大鼠的脑组织细胞排列整齐，细胞间隙均匀，细胞形态完整，神经元形态完整，微血管腔无阻塞；与假手术组相比，模型组大鼠的脑组织细胞排列混乱，细胞间隙增大，细胞核皱缩，空泡细胞增多，神经细胞出现凋亡，个别微血管呈红色条形的管型。图3 是各组随机选3 只大鼠的HE染色结果。

图3 弥漫性脑血栓模型大鼠脑组织的HE染色结果（×40）Figure 3 HE staining of brain tissue in diffuse cerebral thrombosis model rats（×40）

3 讨论

EB为偶氮基荧光染料，进入血液后与血浆白蛋白高度结合，正常情况下该结合物无法透过血脑屏障；当血脑屏障被破坏时，通透性升高，该结合物方可透过血脑屏障进入脑组织。脑损伤程度与血脑屏障通透性呈正相关，损伤越严重，血脑屏障的通透性越高，即EB透过的量越多，染蓝程度越深。因此检测脑组织中EB 渗出的含量可判断脑损伤的程度［6-7］。HE 染色为经典的组织病理检查方法［8］，操作简单，结果可靠，其中伊红染料可使不同形态的细胞因其成分不同呈现出深浅不一的粉红色［9-10］。缺血性脑卒中发生后，脑组织细胞质浓缩红染；神经细胞出现凋亡，排列紊乱，数量减少；细胞核皱缩、碎裂；微血管呈红色条管型；细胞肿胀，可见胶质水肿，并出现凋亡，形成大量空泡细胞［11-12］。

相较于经典方法［3］，本研究有以下创新之处：（1）规定进行右侧切口，较正中切口更便于颈总动脉、颈外动脉的分离，减少动物出血和对气管的刺激，避免气管痉挛和过多分泌物的产生，减少动物死亡率［5］。而且左侧迷走神经直接分布于心脏，进行手术将影响心脏功能，于右侧操作可减少不必要的脑外因素。（2）改进动物麻醉方式，采用异氟烷吸入麻醉代替戊巴比妥钠麻醉，避免动脉收缩压和平均动脉压升高而造成动物心率降低，并在术中、术后对动物进行保温，减轻呼吸及心脏功能抑制，降低死亡率。（3）改进花生四烯酸的保存方式，将花生四烯酸充氮气密封存于－80 ℃冰箱，造模液（花生四烯酸-生理盐水）现用现配，提高花生四烯酸的稳定性。（4）规范造模方式，用7～8周龄（体质量为250～300 g）的雄性SD大鼠实施手术。（5）用肝素-生理盐水对手术引导管进行抗凝处理，防止血凝块阻塞引导管。

本实验结果显示，较假手术组，模型大鼠缺血侧出现弥漫性EB渗出量明显增加（P＜0.01）；且缺血侧脑组织细胞排列紊乱，部分皱缩，染色加深，空泡细胞增多，神经细胞出现凋亡。结果提示缺血侧血脑屏障被破坏，大鼠弥漫性脑血栓模型复制成功，且模型大鼠死亡率低、稳定性好。

目前临床脑血栓的发生受多因素、多途径诱导，血管内皮细胞损伤与收缩、血小板活化与聚集、纤维蛋白凝固、血管壁炎性反应、斑块的不稳定性增加、斑块破裂、局部栓子形成等都与脑血栓的形成密切相关［13］。因此，用花生四烯酸诱导建立脑血栓模型适用于由血小板活化与聚集、血管内皮损伤导致的血栓栓塞性相关疾病的研究。