四种天然产物对棉铃虫杀灭效果研究

□ 杨雪峰 张皓添 陈晓萱 范笑妍 周 延

（北京化工大学，北京 100029）

一、引言

（一）植物源农药研究意义

天然产物常表现出许多特殊的生物特性，千百年来被人们发现、利用，过去常作为天然杀虫剂直接应用于实际生产来解决病虫害问题，而今又在创制天然产物源农药和杀虫物质中起到重要作用。当今世界至少有25万种不同植物，而在化学性质上进行过调查研究的仅占10%，天然产物的杀虫功效还有很大研究空间。加之近年来，有机合成农药所造成的环境污染日益严重，因此，开发和应用植物源农药已成为各国所追逐的目标［1，2］。我国要全面加强生态环境保护，坚决打好污染防治攻坚战。天然产物配方的杀虫剂前景广阔，使用简单，带来的环境负担大大减小，更适合大规模施用，并且代表着未来杀虫剂发展的新方向。

（二）国内外研究现状

目前，我国农业上正在经历从使用对环境有较大破坏作用的纯化学杀虫剂到使用环境友好型天然产物杀虫剂的转变过程。使用纯化学杀虫剂防治棉铃虫害的方法之一是施用三氟氯氰菊酯。但是研究表明，棉铃虫已经对三氟氯氰菊酯表现低水平抗性［3］，且这种物质对人体有害，严重者将危及生命。并且三氟氯氢菊酯的降解周期长，降解速度慢，在环境中易积累，且耐雨水冲刷，仅能通过土壤中的微生物缓慢辅助降解，可造成土地污染，在食物中亦可能有残留［4］。

国际上对天然产物类的杀虫剂很早就开始了研究，其中精油类的天然产物引起了研究人员的极大兴趣［5］。精油中的烯类物质和萜类物质对昆虫具有很强的毒害驱赶作用［6］。苦木科鸦胆子属植物含有苦木内酯类、三萜类、生物碱类、黄酮类及甾体类等多种化合物，不仅在医学上被广泛应用，其生物活性成分还可以抑制棉铃虫害，是开发植物源杀虫剂的良好材料［7］。桉叶精油的主要成分有1，8-桉叶油素、α-蒎烯等，其对棉铃虫的生长繁殖有一定的抑制作用［8］。岗松精油对棉铃虫等害虫具有较高的杀虫活性，且来源于天然植物，不含有机溶剂，具有无公害、安全高效的特点，能够作为绿色、安全植物源农药开发的潜在植物材料。苦参碱是一种可溶性药剂，也是一种非常好的植物源杀虫剂。利用苦参碱制作的材料具有天然性特征，成品药剂在田间使用时呈现可溶性，因此不会对环境造成污染。植物源杀虫剂在使用后不会在土壤和作物上形成过量残留，不影响其后续种植。在农药中添加1%的苦参碱能够有效防治各个虫龄的棉铃虫，比起化学药物等具有突出的优越性［9］。

（三）农害棉铃虫

棉铃虫（Helicoverpa Armigera）是世界性广布害虫，对棉花、玉米、非洲水稻等粮食作物危害严重，其取食农作物幼嫩生长点和繁殖器官，幼虫钻蛀，啃食花蕾［10］。现阶段主要采用化学农药对棉铃虫进行防治。化学农药的长期和反复使用，易造成害虫抗药性的增加和环境污染。对于农害棉铃虫虽有转Bt基因抗虫棉的种植，但是长期、单一、大面积种植转Bt基因抗虫棉，会加大对棉铃虫的选择压力，从而导致棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性上升［11］。因此，绿色高效、环境友好型植物源农药已引起专家学者的广泛关注。芳香植物多含有丰富的植物精油和抗虫性化合物，是发现和提取植物源农药的良好材料。例如，狭叶菖蒲含有苯丙素类，黄酮类和萜类等多种具有驱虫杀虫和抗虫活性的次生化合物［12］。另外，苦参碱，水杨酸，茉莉酸，植物漆酶等天然产物也有一定的驱虫功效，尤其对于棉铃虫［13］。鉴于有许多已知或未知的天然植物产物可以起到同等或者更优良的杀虫效益，且大幅度减少环境污染与对于人体健康的危害，本研究致力于探究四种天然产物对棉铃虫的杀灭效果。

二、材料和方法

（一）材料

1.供试昆虫

供试昆虫棉铃虫（购于河南省济源白云实业有限公司），购买虫态为卵。室内（温度26±1℃，相对湿度40%～70%，光周期L：D=14h∶10h）［14］孵化后，用人工饲料（购于河南省济源白云实业有限公司），饲养于养虫桶内（密度约50头/L），选取相同生理状态的3龄幼虫作为供试昆虫。

2.试剂及仪器

试剂：

PEG2000（购于山东优索化工科技有限公司）；

K1，鸦胆子（购于南昌青亳网络科技有限公司）；

桉叶精油（岗松精油由北京化工大学提供）。

仪器：

电子天平（北京化工大学提供）；

集热式搅拌器（北京化工大学提供）。

（二）棉铃虫的饲养方法

3龄前幼虫饲养：用75%酒精对养虫桶内壁进行消毒，置于通风橱内15min后取出。将切割为1cm×1cm×1cm大小的人工饲料块置于养虫桶底部，铺满一层即可。将带有卵的棉网置于饲料上方，后对养虫桶桶口用尼龙网纱布（100目）进行封盖。将养虫桶置于室内（温度26±1℃，相对湿度40%～70%，光周期L∶D=14h∶10h）［14］人工饲养。

3龄后幼虫饲养：3龄后幼虫单独饲养于90mm一次性塑料培养皿中，每个皿中投入4±0.1g（湿重）人工饲料。

成虫饲养：将虫蛹提前置于80cm×80cm×80cm养虫笼内，待羽化后，向养虫笼内放入盛有浸透10%蜂蜜水脱脂棉的塑料培养皿作为营养源，并及时更换蜂蜜水脱脂棉。

（三）四种天然产物不同浓度药液的配制

1.桉叶精油、岗松精油

以PEG2000为增溶剂，水为溶剂，通过恒温搅拌将桉叶精油和岗松精油分别配制成质量分数0.08%、0.80%、2.40%、4.80%、8.00%的精油药液。桉叶精油和岗松精油为具有特殊气味的透明液体，且具有易挥发的性质，在配制过程中应注意密封。配制完成后置于12±1℃的环境中冷藏。

2.苦参碱、鸦胆子

以水为溶剂，将苦参碱干粉和鸦胆子干粉分别配制成质量分数0.08%、0.80%、2.40%、4.80%、8.00%的药液，并震荡24h。震荡完成后置于12±1℃的环境中冷藏。

（四）四种天然产物药液自身毒性的测定

采用豆芽浸泡法测定4种天然产物药液的自身毒性。

豆芽制备：取大小相同，饱满度一致的黄豆置于培养皿皿盖中，每皿20～30粒。向皿盖中加水，直至水面恰好没过黄豆，后将与皿盖大小相近的纱布覆于水面上，重复操作。将处理后的黄豆置于室温，每隔12h加一次水，待其发芽且芽长3cm左右。

豆芽浸泡法：取芽长3cm左右且生理状况一致的豆芽，记录豆芽长度。后分别在4种天然产物的系列浓度中浸泡2～3s，取出后用吸水纸吸去表面药液。向1个空培养皿皿盖中添加10个相同处理的豆芽，并向皿盖中加水直至水面没过豆芽。以清水为对照，每处理豆芽10个，重复3次。将处理后的豆芽置于室温，每隔12h加一次水。24h后分别测量每个皿中豆芽长度，计算生长抑制率。

（五）四种天然产物药液对棉铃虫拒食活性的测定

采用叶碟法［15，16］测定四种天然产物药液对棉铃虫的拒食活性。将新鲜的玉米叶片洗净、晾干，用打孔器制成大小一致的叶碟（直径2.5cm）。将叶碟分别在4种天然产物的系列浓度中浸泡2～3s，取出自然晾干。向1个空培养皿中添加3片相同处理的叶碟，后分别接入1头经饥饿处理4h且生理状态相同的3龄幼虫。以清水为对照，每处理幼虫10头，重复3次。将处理后的试虫置于温度26±1℃，相对湿度40%～70%，光周期L∶D=14h∶10h条件下饲养。24h后，分别测量每个皿中叶碟剩余面积及试虫死亡数，计算拒食率、死亡率及校正死亡率，得到拒食中浓度［17，18］。

（六）桉叶精油药液、岗松精油药液对棉铃虫触杀活性的测定

精油药液的配制：配制不同精油的药液，质量浓度分别为4.00%、6.00%、8.00%，方法同上。

对3龄幼虫触杀活性：采用滴虫法测定触杀活性。取相同生理状况的棉铃虫3龄幼虫，每个培养皿中补充添加4±0.1g（湿重）的人工饲料。用移液枪分别移取不同浓度的精油药液100μL，精准缓慢滴加在幼虫虫身上，滴加完成后盖好皿盖。以清水为对照，每处理幼虫10头，重复3次。将处理后的试虫置于温度26±1℃，相对湿度40%～70%，光周期L∶D=14h∶10h条件下饲养。24h、48h后，分别测量试虫死亡数，计算死亡率及校正死亡率。

对5龄幼虫触杀活性：采用滴虫法测定触杀活性。除处理试虫为生理状况相同的棉铃虫5龄幼虫外，其余操作同上。

（七）四种天然产物对棉铃虫胃毒活性的测定

采用饲喂称重法［19］测定四种天然产物对棉铃虫的胃毒活性。将四种天然产物分别按照质量分数0.08%、0.80%、2.40%、4.80%、8.00%（干重）加到人工饲料中，并充分混匀，对照组不作处理。向1个空培养皿中添加4±0.1g相同处理的人工饲料，后分别接入1头经饥饿处理4h、生理状态相同且完成称重的3龄幼虫。以不作处理的人工饲料为对照，每处理幼虫10头，重复3次。将处理后的试虫置于温度26±1℃，相对湿度40%～70%，光周期L∶D=14h∶10h条件下饲养。在处理后的第1、3天逐头称重，测量试虫死亡数，计算体重抑制率，死亡率及校正死亡率。

三、结果与分析

（一）四种天然产物药液自身毒性

四种天然产物药液系列浓度对黄豆芽生长影响见表1。精油类天然产物药液浓度越大，对黄豆芽的生长抑制越强，但低浓度的精油类天然产物药液对黄豆芽有促进生长作用。非精油类天然产物药液对黄豆芽生长影响较小，且浓度的高低对黄豆芽生长影响的差别不大。其中，8.00%质量浓度的岗松精油对黄豆芽的生长抑制最明显，达到了10.25%。

表1 四种天然产物药液系列浓度对黄豆芽生长影响

（二）四种天然产物药液对棉铃虫的拒食活性

四种天然产物药液对棉铃虫幼虫的拒食活性见表2、表3。四种天然产物系列浓度药液对供试的棉铃虫幼虫均表现出较好的拒食活性。岗松精油药液随着浓度的增加，对棉铃虫幼虫的拒食率呈下降趋势，药液浓度为0.08%时拒食效果最好，达52.75%；桉叶精油药液拒食率随着药液浓度的增大先增大后降低，其中，药液浓度为0.80%时拒食效果最好，达50.30%；鸦胆子药液拒食率随着药液浓度的增大先增大后降低，其中，药液浓度为0.80%时拒食效果最好，达62.74%；苦参碱不同浓度的药液拒食效果基本一致，基本稳定在54.00%左右，其中0.80%时拒食效果最差，为46.88%。桉叶精油，岗松精油，鸦胆子，苦参碱药液的拒食中浓度分别为0.22，1.92，5.44，1.61g·g-1。

表2 四种天然产物药液对棉铃虫的拒食活性

表3 四种天然产物药液对棉铃虫的拒食中浓度

（三）桉叶精油药液、岗松精油药液对棉铃虫的触杀活性

桉叶精油、岗松精油对棉铃虫3龄、5龄幼虫的触杀活性见表4、表5。桉叶精油和岗松精油的药液对棉铃虫幼虫的触杀活性均随着药液浓度的增大而提高。桉叶精油和岗松精油的药液对棉铃虫3龄幼虫的触杀活性表现较好，其中，8.00%的桉叶精油药液效果最好，校正死亡率达91.67%，8.00%的岗松精油药液也超过了半数致死率，并且桉叶精油不同浓度药液对棉铃虫3龄幼虫的触杀活性普遍高于岗松精油。而桉叶精油和岗松精油的药液对棉铃虫5龄幼虫的触杀活性表现较差，两者最高浓度的药液均没有达到半数致死率，并且，对棉铃虫5龄幼虫的处理，桉叶精油药液和岗松精油药液不同浓度间没有表现出很大的差异性。

表4 桉叶精油，岗松精油药液对棉铃虫3龄幼虫的触杀活性

表5 桉叶精油，岗松精油药液对棉铃虫5龄幼虫的触杀活性

（四）四种天然产物对棉铃虫的胃毒活性

四种天然产物对棉铃虫的胃毒活性见表6，表7。四种天然产物对棉铃虫幼虫的胃毒活性表现均较差，其中桉叶精油和鸦胆子的胃毒活性在四种天然产物中表现较好，8.00%质量分数的桉叶精油致死率达到了13.80%，8.00%质量分数的鸦胆子致死率达到了10.35%。但四种天然产物对棉铃虫的体重抑制率表现均较好，岗松精油对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高先降低后升高，在2.40%质量分数时出现了促进棉铃虫生长的状况；桉叶精油对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高呈不稳定上升趋势，其中8.00%质量分数的桉叶精油对棉铃虫幼虫的体重抑制率第3天达到了70.97%；鸦胆子对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高变化不稳定，在25.00%附近；苦参碱对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高先降低后升高。

表6 四种天然产物对棉铃虫幼虫的胃毒活性

四、讨论

（一）四种天然产物药液自身毒性的讨论

本实验通过将4种天然产物系列浓度的药液作用于发芽且生理状况相同的黄豆芽上，通过黄豆芽生长长度的变化来判断天然产物药液是否对植株生长有毒害作用。此方法用生长周期短、发芽快的黄豆代替了试虫主要虫害的农作物棉花，虽然此实验与实际情况有一定的差距，但其结果仍有一定的参考价值。

桉叶精油和岗松精油的药液在低浓度时均表现出了对黄豆芽生长的促进作用，这可能与精油类物质中的相关成分有关［20］，精油浓度低时起促进作用，精油浓度过高时起抑制作用。相比于精油类物质，非精油类的鸦胆子和苦参碱的药液对黄豆芽的生长影响较小，推测其水提物中对黄豆芽生长影响的因子很少。从实验结果来看，岗松精油药液低浓度时对黄豆芽生长的促进作用最强，高浓度时抑制作用也最强，但4种天然产物药液的影响均不是很明显，由此可判断出这4种天然产物药液具有可应用性。

（二）四种天然产物药液对棉铃虫拒食活性的讨论

本实验采用了叶碟法测定四种天然产物对棉铃虫的拒食活性，考虑到实验的易操作性和材料的易获取性，用玉米叶片［11］代替了棉花叶片。本实验结果表明，四种天然产物系列浓度药液对棉铃虫幼虫均表现出较好的拒食活性。在实际生产生活中，植物体会产生不同的化学物质，当昆虫摄取这些化学物质后，会引起昆虫体内的生理生化机制发生改变进而调节其生长发育过程［21］。这四种天然产物种特殊成分在棉铃虫幼虫进食时，直接或间接地抑制了昆虫口器的化学感受器，进而使其失去味觉功能，表现出局势反应［22，23］，从而使其因摄取不到足够营养影响到自身的生长发育。

从实验结果中可观察到，四种天然产物系列浓度药液的校正死亡率与其拒食率基本成反比，可推断出4种天然产物对棉铃虫幼虫的杀灭作用主要通过其进食完成的，即以胃毒作用为主。在以后的研究中，可将系列浓度细分，得到确切的关系曲线，在考虑拒食率、死亡率以及其他因素（如成本，易操作性等）下，得到最适的药液浓度。四种天然产物的AFC50分别为：岗松精油0.22g·g-1，桉叶精油1.92g·g-1，鸦胆子5.44g·g-1，苦参碱1.61g·g-1。鸦胆子的AFC50最高，说明其对棉铃虫幼虫的拒食活性不高。桉叶精油和苦参碱的AFC50相近，推测其具有相似的作用于棉铃虫幼虫的机制。

（三）桉叶精油药液、岗松精油药液对棉铃虫触杀活性的讨论

本实验采用自创滴虫法进行触杀活性实验，因考虑实际生产生活中喷洒农药时以农药溶液滴落在昆虫虫身上情况居多，故采用此法。相比于浸虫法［12］，实验结果更贴近实际，更便于实际应用。从实验结果可推断出鸦胆子及苦参碱的水提物中对生物生长的影响因子很少，而精油中含有多种挥发性物质，易进入动植物体内［20，24］，故本实验只对精油类天然产物进行了实验。从实验结果可以推断出桉叶精油，岗松精油药液在处理24h后活性大大降低，所以出现药液处理48h后校正死亡率与药液处理24h后的结果相比变化不大的情况。在实际生产生活中，应考虑到精油类天然产物药液的作用有效期，及时补充进行二次处理或依据实际生产要求规划好施用时间。

从实验结果中也可以看出，棉铃虫幼虫随着虫龄的增长，对桉叶精油，岗松精油药液的抗性逐渐增大，因此，在实际生产生活中，应该在虫害发生前期及时进行处理，越早处理效果越好，也更加经济。

（四）四种天然产物对棉铃虫胃毒活性的讨论

本部分实验采用饲喂称重法来测定四种天然产物对棉铃虫的胃毒活性。从实验结果可以看出，不同天然产物与人工饲料混合后对棉铃虫幼虫进行处理的表现各不相同，没有统一的特点。

岗松精油，随着质量浓度的增加，对棉铃虫幼虫的体重抑制率先降低后升高，并在2.40%质量浓度时出现了促进棉铃虫幼虫生长的现象；而对应的校正死亡率没有大的差别且都很低。在0.08%质量浓度时第1天和第3天的体重抑制率各达到了61.81%和60.33%。

桉叶精油，随着质量浓度的增加，对棉铃虫幼虫的体重抑制率总体升高，但在4.80%质量浓度时出现了体重抑制率大幅降低的现象，推测这个现象与岗松精油对棉铃虫幼虫体重抑制率随质量浓度增加先降低后升高的现象类似，区别在于谷值大小和变化区间长短不同。在8.00%质量浓度时第1天和第3天的体重抑制率各达到了70.34%和70.97%。在以后的研究中可将系列浓度细分，得到确切的关系曲线，验证此推论是否正确。

苦参碱，随着质量浓度的增加，对棉铃虫幼虫的体重抑制率先降低后升高，与岗松精油的表现类似，并且对应的校正死亡率也是没有太大的差别并且都很低，推测苦参碱和岗松精油作用于棉铃虫幼虫的方式具有相似性。

鸦胆子，随着质量浓度的增加，对棉铃虫幼虫的体重抑制率总体趋势不稳定，在25.00%附近。推测鸦胆子内的化学物质在与饲料混合后大大降低了其对棉铃虫的拒食作用［25］。并且在实验中可以得到四种天然产物的AFC50值，其中鸦胆子的AFC50最高，也间接验证了该猜想。虽然鸦胆子对棉铃虫幼虫的体重抑制率不高，但在该实验中其校正死亡率普遍高于其他三种物质。这说明鸦胆子对棉铃虫幼虫作用后，以直接致死的作用方式为主［26，27］，而没有致死的试虫没有表现出对鸦胆子的明显拒食反应。所以，推测鸦胆子对棉铃虫幼虫作用方式以胃毒为主，且不会引起棉铃虫幼虫强烈的拒食反应。

五、结语

（一）四种天然产物药液具有可应用性

桉叶精油和岗松精油的药液在浓度低时起促进作用，精油浓度过高时起抑制作用。非精油类的鸦胆子和苦参碱的药液对黄豆芽的生长影响较小，促进和抑制作用都不明显。从整体看来，这四种天然产物药液具有可应用性。

（二）四种天然产物药液对棉铃虫均具有拒食活性

桉叶精油、岗松精油、鸦胆子、苦参碱系列浓度药液校正死亡率与其拒食率基本成反比，四种天然产物的AFC50分别为：岗松精油0.22g·g-1，桉叶精油1.92g·g-1，鸦胆子5.44g·g-1，苦参碱1.61g·g-1。岗松精油的拒食活性最高，鸦胆子的拒食活性最低。

（三）桉叶精油药液、岗松精油药液对棉铃虫均具有触杀活性

棉铃虫幼虫随着虫龄的增长，对桉叶精油，岗松精油药液的抗性逐渐增大，因此在实际生产生活中，应该在虫害发生前期及时进行处理，越早处理效果越好，也更加经济。桉叶精油和岗松精油的药液对棉铃虫3龄幼虫的触杀活性表现较好，其中，8.00%的桉叶精油药液效果最好，校正死亡率达91.67%。

（四）四种天然产物对棉铃虫均具有胃毒活性

桉叶精油、岗松精油、鸦胆子、苦参碱对棉铃虫幼虫的胃毒活性表现均较差，其中桉叶精油和鸦胆子的胃毒活性在四种天然产物中表现较好，8.00%质量分数的桉叶精油致死率达到了13.80%，8.00%质量分数的鸦胆子致死率达到了10.35%。

桉叶精油、岗松精油、鸦胆子、苦参碱对棉铃虫幼虫的体重抑制率表现均较好，岗松精油对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高先降低后升高，在2.40%质量分数时出现了促进棉铃虫生长的状况；桉叶精油对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高呈不稳定上升趋势；鸦胆子对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高变化不稳定，在25.00%附近；苦参碱对棉铃虫幼虫的体重抑制率随质量分数的升高先降低后升高。岗松精油在0.08%质量浓度时第1天和第3天的体重抑制率各达到了61.81%和60.33%。桉叶精油在8.00%质量浓度时第1天和第3天的体重抑制率各达到了70.34%和70.97%。