地黄饮子减少老龄大鼠脑组织缺血再灌注损伤的机制研究*

郑 娅 董其武 王兆婷

宁波市康复医院 浙江 宁波 315040

缺血性脑卒中在我国脑卒中患者数量中居首位。患者人群中，老年人占比最大，给国家经济带来了较重的负担[1-2]。临床上以抗血小板凝集、强化降脂等治疗方法为主，虽已取得了较好的疗效，但早期复发率高达30%，且伴随着高致死率和高致残率，所以减轻其复发率是现如今研究的重点。治疗该疾病的根本是对缺血部位及时恢复供血[3-4]，一些研究结果显示，对脑缺血部位及时供血虽可恢复缺血部位的正常功能，不过也会造成脑缺血再灌注损伤（CIRI）[5]。因此，寻找价格低廉、切实有效的防治CIRI的药物是目前研究的热点。

脑卒中可归属于中医学“中风”范畴[6]。地黄饮子（DY），为《古代经典名方目录（第一批）》，其药物组成为熟地黄、白茯苓、麦门冬、石菖蒲、附子、五味子、官桂、远志、山茱萸、石斛、肉苁蓉等，在临床上防治脑卒中效果较好[7-9]。地黄饮子在动物实验中有较好的表现，对于CIRI所引发的神经损伤有一定的缓解作用，使脑梗死率降低，缓解脑卒中病理改变[10-11]，课题组前期研究发现脑缺血再灌注模型大鼠血小板LC3、Beclin1蛋白显著增加，地黄饮子干预后能有效降低自噬水平。基于此，本实验进行进一步探究，研究地黄饮子是否通过减轻血小板自噬降低CIRI的损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物：从上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买的50只40周雄性SD大鼠，体质量500～700g，动物生产许可证号SCXK（沪）2018-0008，在杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心饲养，动物使用SYXK许可证号（浙）2020-0024。实验前适应性饲养，室温为22±2℃，相对湿度为60%。

1.2 实验材料与试剂：地黄饮子，由本院中药房提供。其方剂组成：熟地黄18g，茯苓、山茱萸、肉苁蓉各12g，麦门冬、石斛、巴戟天各10g，远志9g，石菖蒲8g，五味子6g，附子、肉桂、薄荷各4g，生姜3g，大枣5个。以上中药浸泡在5倍体积的水中45min，后在沸腾温度下煎煮半小时，取出煎液。在3倍体积的水中继续煎煮两次，最后将汤液全部收集，过滤，浓缩至2g/ml，4℃冰箱保存。Beclin-1、Phospho-IKB epsilon(Ser161)、LC3 A/B、APG5L/ATG5、GAPDH、CD62P Antibody（批号：AF5128、AF3002、AF5402、DF6010、AF1027、DF13294，江苏亲科生物研究中心有限公司）；组化试剂盒AEC显色剂（批号：G1211，武汉塞维尔生物科技有限公司）；大鼠β血小板球蛋白/β血栓环蛋白(β-TG)、大鼠血小板因子4(PF-4/CXCL4)ELISA试剂盒（批号：MM-0531R1、MM-0083R1，江苏酶免实业有限公司）。

1.3 实验仪器：从Leica购入RM2235型石蜡切片机、DM3000型正置荧光显微镜，从Thermo购入Micro17R型低温高速离心机，从上海徕卡仪器有限公司购入RM2016型病理切片机，从雅培公司购入C16000型全自动生化检测仪。

1.4 CIRI模型构建及实验分组：大鼠常规麻醉备皮，于颈中部剪开，分离左侧颈总动脉及颈外动脉；对左侧颈总动脉进行结扎并于颈总动脉剪一小口,插入线栓，当有阻力产生时停止操作，约18mm，扎紧固定、缝合，90min后退出线栓，实现再灌注。假手术组不进行栓塞便缝合伤口，其余同手术组。在实验过程中检查并保持实验大鼠体温在37±0.6℃。术后第1d起，将大鼠分为假手术组、模型对照组（CIRI组）、CIRI+DY 6g/kg组、CIRI+DY 12g/kg组、CIRI+尼莫地平10mg/kg组（n=10）。按照剂量配比进行地黄饮子及阳性对照药灌胃处理，假手术组给予等体积生理盐水，实验开展28d。

1.5 HE染色：将大鼠脑组织样本分离出来，在多聚甲醛中进行固定，脱水、包埋、切片后进行HE染色，镜检。采集分析样本相关部位，同时根据脑细胞形态结构与细胞周围情况进行打分：正常为0分；少量细胞损伤，细胞周围无空泡为1分；细胞明显损伤，空泡少为2分；细胞损伤明显，空泡明显为3分；细胞严重损伤，出现大量空泡为4分，并进行记录。

1.6 TTC染色：取麻醉后大鼠的新鲜脑组织，经速冻、解冻、切片后放入37℃的TTC孵育液中，避光操作孵育0.5h，显微镜下观察。

1.7 脑水肿检测：解剖大鼠大脑同侧和对侧半球，并测定组织的湿重。将组织在120℃下干燥24h。脑水百分比=（湿重—干重）/干重×100%。

1.8 Western blot检测：提取大鼠脑组织蛋白，测定总蛋白的浓度，电泳，转PVDF膜，TBST洗膜。行免疫印迹反应，封闭液封闭，加含一抗稀释液，4℃过夜进行孵育，弃一抗，加二抗，在摇床上振荡反应1h，回收二抗，TBST洗膜。以GADPH为内参，化学发光仪显影，chemi capture软件分析图像，测定各组大鼠脑组织中Beclin-1、Atg5、LC3的蛋白表达。

1.9 免疫组化检测：石蜡切片进行组织抗原修复，之后进行过氧化物酶阻断并进行封闭，加入一抗后加二抗，进行显色、封片、镜检。

1.10 ELISA检测：按照ELISA试剂盒说明测定大鼠血清中β-TG和PF4的含量。

1.11 统计学处理：统计分析软件利用SPSS 16.0，One-way-ANOAY单因素方差分析用于计量资料多组间的比较，SNK分析用于组间比较。Kruskal-Wallis H用来检验方差不齐者。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地黄饮子对CIRI大鼠大脑皮层组织病理学变化的影响：见图1。与假手术组相比，CIRI组大鼠神经细胞数量显著减少，排列不规则，细胞核固缩出现大量坏死细胞，HE半定量评分显著减少；与CIRI组相比，CIRI+DY 6g/kg组大鼠神经元细胞固缩有所改善，CIRI+DY 12g/kg组大鼠脑组织病理学损害有所减轻，坏死细胞明显减少，CIRI+尼莫地平10mg/kg组大鼠细胞固缩改善情况最明显，同时CIRI+DY 12g/kg组与CIRI+尼莫地平10mg/kg组HE半定量评分极显著降低。见表1。

图1 大鼠大脑皮层组织病理学改变

表1 大鼠大脑皮层组织HE半定量评分表（±s，n=6）

表1 大鼠大脑皮层组织HE半定量评分表（±s，n=6）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与CIRI组比较，##P＜0.01。

半定量评分0.00±0.00 3.33±0.52**3.17±0.41 1.50±0.55##1.33±0.52##组别假手术组CIRI组CIRI+DY 6g/kg组CIRI+DY 12g/kg组CIRI+尼莫地平10mg/kg组

2.2 CIRI大鼠脑梗死面积的变化：如图2，相较于假手术组，CIRI组大鼠脑白色梗死区域显著增多，梗死率升高（P＜0.01）；与CIRI相比，CIRI+DY 6g/kg组、CIRI+DY12g/kg组与CIRI+尼莫地平10mg/kg组大鼠脑梗死面积显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

图2 CIRI大鼠脑梗死率（±s，n=6）

2.3 地黄饮子对CIRI大鼠脑水肿情况的影响：与假手术组比较，CIRI组大鼠脑含水量极显著上升（P＜0.01）；与CIRI组比较，CIRI+DY 12g/kg和CIRI+尼莫地平10mg/kg组大鼠脑含水量显著降低（P＜0.01，P＜0.05），见图3。

图3 大鼠脑含水量情况（±s，n=6）

2.4 地黄饮子对CIRI大鼠脑组织中Beclin-1、LC3 II/LC3 I和Atg5蛋白表达情况的影响：相较于假手术组，CIRI组大鼠的脑组织中三种蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.01）；相较于CIRI组，CIRI+DY 12g/kg组与CIRI+尼莫地平10mg/kg组三种蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 大鼠脑组织中Beclin-1、Atg5、LC3蛋白表达条带图（± s，n=4）

2.5 地黄饮子对CIRI大鼠CD62P含量的影响：见图5。与假手术组比较，CIRI组大鼠CD62P的含量呈现出升高的趋势（P＜0.01）。CIRI+DY 12g/kg组、CIRI+尼莫地平10mg/kg大鼠脑组织中CD62P的蛋白表达量与CIRI组相比较显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

图5 免疫组化检测脑组织CD62P的表达情况（±s，n=4）

2.6 地黄饮子对CIRI大鼠血清中β-TG和PF4含量的影响：从图6可以看出CIRI组β-TG和PF4含量与假手术组比较均有所升高（P＜0.01）；β-TG和PF4的含量与CIRI组比较降低的是CIRI+DY 12g/kg和CIRI+尼莫地平10mg/kg组（P＜0.01或P＜0.05）。

图6 大鼠血清中β-TG和PF4的含量（±s，n=6）

3 讨论

CIRI发生后可促使一系列级联反应的发生，对脑组织及神经带来再次损伤，影响脑部正常功能。多年来，对于CIRI的预防和治疗虽然得到了较大的改善，但相关的分子生物学机制尚未明晰。临床上用于CIRI以药物治疗为主，包括西药，中药有效成分、提取物或复方以及针灸疗法[12]。地黄饮子为经典名方目录入选方，对CIRI治疗效果较好，且有大量相关临床数据佐证[13]。研究显示，地黄饮子能够从抑制细胞自噬层面发挥作用，从而使脑神经细胞增殖加快、抑制细胞的氧化反应等多种反应途径和机制来减轻脑组织损伤[14]。本研究结果显示，在CIRI老龄大鼠模型中，地黄饮子可明显改善缺血再灌注对脑组织的病理学损伤，减少细胞坏死和核固缩现象，并有效减少脑缺血造成的脑梗死和脑水肿。

细胞自噬是一种在基因调控下通过溶酶体对体内受损细胞和大分子、细胞器进行清除转化成供机体利用的物质的作用过程。在以往出生的新生大鼠中，出现缺氧情况就会导致自噬相关蛋白表达水平升高，而这些蛋白主要包括LC3、Beclin-1[15-17]，表明缺血导致的脑损伤与细胞自噬有一定的相关性。在自噬过程中，LC3的羧基末端脂质修饰即LC3Ⅱ的增加是自噬体形成所需的特征性表现，在以往研究中发现CIRI大鼠脑组织自噬标志蛋白LC3、Beclin-1显著增加，而地黄饮子的干预能有效降低自噬水平。本实验也更好地验证了这一点，通过Western blot实验可以直观地反映出CIRI组大鼠脑组织中Beclin-1、LC3 II/LC3 I和Atg5蛋白表达显著升高，而在加入地黄饮子后的CIRI+DY 12g/kg组Beclin-1、LC3 II/LC3 I和Atg5蛋白的表达水平均显著降低，提示地黄饮子干预后确能有效降低脑组织细胞的自噬水平，使缺血侧脑组织病理损伤程度减轻，发挥神经功能保护性作用。

血小板内静息信息调节剂2同系物1（SIRT1）通过蛋白酶体和溶酶体途径抑制体外血小板聚集和血栓形成。已知在含有SIRT1和肝激酶B1的胞质复合物中（Liver kinase B1，LKB1），AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的激活受 LKB1调节，SIRT1是LKB1去乙酰化和激活所需的[18]。AMPK和哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）这两种信号分子又呈相互拮抗的时向关系。可见在血小板中SIRT1-AMPK-mTOR信号通路抑制了自噬。β-TG和PF4与血小板α颗粒有着密切的关系，当血小板活化水平升高，β-TG和PF4的浓度就会随之增加。有研究评估了分支动脉粥样硬化性脑梗死患者β-TG和PF4的水平，发现脑梗死患者血小板活性通常升高[19]。其他相关研究中也指出，凝血系统、纤溶系统以及Tem失衡也会引起脑血栓，CD62P是一种位于血小板上的糖蛋白，对血小板的黏附有一定的介导作用，同样可以反映血小板活化水平。在一项268例病例的研究中发现，CD62P的水平以重度脑梗死患者最高[20]。在本研究中，与CIRI组比较，CIRI+DY 12g/kg组大鼠脑组织中CD62P的蛋白表达量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），大鼠血清中β-TG和PF4的含量显著降低（P＜0.05）。这表明地黄饮子抑制了血小板的活化及聚集，并降低了血小板的黏附功能。

综上所述，本研究表明在CIRI大鼠模型中，地黄饮子对于减轻CIRI有重要作用，其作用机制可能是通过抑制血小板活化及自噬途径，进而下调血小板聚集和血栓形成等过程实现的。