头孢哌酮-舒巴坦联合多黏菌素E等6种抗菌药物对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌作用研究

胡永煜 ， 吴 湜 郑永贵 杨 洋 郭 燕 胡付品

鲍曼不动杆菌是临床最常见的导致医院感染的病原菌之一。由于该菌天然产生OXA-23型碳青霉烯酶而使其在体外具有较强的水解亚胺培南和美罗培南的活性，并在环境中具有顽强生命力，因而成为临床抗感染治疗的难题。2018年CHINET中国细菌耐药监测结果显示，23 573株不动杆菌属占所有受监测临床分离菌（244 843株）的9.6%，其中94%是鲍曼不动杆菌，且其对亚胺培南和美罗培南的耐药率均超过70%[1-2]。碳青酶烯类耐药鲍曼不动杆菌也显示对其他抗菌药物的耐药性，常发生多重耐药（MDR）或广泛耐药（XDR），常因无合适抗菌药物而导致感染后的高死亡率，对临床抗感染治疗形成巨大挑战[3]。舒巴坦作为对鲍曼不动杆菌具有抗菌活性的β内酰胺酶抑制剂，其与第三代头孢菌素（头孢哌酮）联合是治疗鲍曼不动杆菌感染的主要抗菌药物之一[4]。本研究主要评价头孢哌酮-舒巴坦与多黏菌素E、阿米卡星、替加环素、美罗培南、左氧氟沙星和利福平等6种抗菌药物联合对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的体外药敏试验结果，为治疗该菌所致感染提供实验室参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌 取华山医院抗生素研究所菌种库2018年临床分离的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌保存菌株100株，无同一患者分离的重复菌株。标本来源为深部痰液69株、血液12株、胸水4株、清洁中段尿3株、胆汁3株、腹水3株、脑脊液2株、肺泡灌洗液3株、创面分泌物1株。细菌鉴定采用VITEK MS全自动微生物质谱鉴定系统。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922及铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.1.2 抗菌药物来源和测试浓度 抗菌药物（包括头孢哌酮、舒巴坦、美罗培南、阿米卡星、多黏菌素E、替加环素、利福平、左氧氟沙星）标准品均购自中国食品药品检定研究院技术服务部。药物测试浓度范围分别为头孢哌酮（1～ 2 048 mg/L）、舒巴坦（0.5～1 024 mg/L）、美罗培南（0.125～512 mg/L）、阿米卡星（0.125～512 mg/L）、多黏菌素E（0.03～512 mg/L）、替加环素（0.125～512 mg/L）、利福平（0.125～512 mg/L）、左氧氟沙星（0.125～512 mg/L）。其中头孢哌酮-舒巴坦（2∶1）按1∶0.5～2 048∶1 024 mg/L配制。

1.2 方法

1.2.1 棋盘法联合药敏试验药敏板制备 将抗菌药物标准品按实验设计称量，并按CLSI M100 第29版中关于微量稀释法制备抗菌药物稀释所需溶剂和稀释液要求稀释抗菌药物。其中左氧氟沙星用0.1 mol/L NaOH溶解，利福平以甲醇溶解，溶解后继续用无菌蒸馏水稀释至药敏试验需要的浓度。头孢哌酮、舒巴坦、阿米卡星、替加环素、多黏菌素E均采用无菌蒸馏水溶解。按棋盘法设计原理和CLSI M07第11版中肉汤微量稀释法操作要求，将配制好的不同测试浓度的抗菌药物加入96孔微量板中。

1.2.2 接种菌液制备和菌液接种 从新鲜过夜培养纯分的受试菌平板上直接采用菌落悬浮法配置0.5麦氏浊度菌悬液，然后以双倍CAMHB肉汤稀释100倍，此为药敏试验接种菌悬液（1×106CFU/mL）。于棋盘法联合药敏试验微量板以每孔50 μL接种菌悬液加入含药药敏板中，最终接种菌量为5×105CFU/mL。（35±2） ℃孵育18～20 h后读取 结果。

1.2.3 棋盘法药敏结果的读取 按2019年版CLSI文件要求，读取和记录单药及两药联合后的最低抑菌浓度（MIC），并计算部分抑菌浓度指数 （FIC)[5-7]。

1.2.4 FIC计算和意义 FIC = 联合后甲药MIC/联合前甲药MIC + 联合后乙药MIC/联合前乙药MIC。FIC≤0.5为两药存在协同作用，0.5＜FIC≤1为两药存在相加作用，l＜FIC≤2为两药无相关作用，FIC＞2为两药有拮抗作用[4]。对于出现协同或相加的联合药敏试验结果，均重复2次试验，取2次相同的结果。

2 结果

2.1 碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性

药敏试验结果显示，头孢哌酮-舒巴坦（2∶1)对100株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的MIC值范围为16～256 mg/L，美罗培南、阿米卡星、利福平、左氧氟沙星、多黏菌素E和替加环素的MIC范围分别为16～256 mg/L、0.5～256 mg/L、4～16 mg/L、0.25～64 mg/L、≤0.06～1 mg/L和0.125～8 mg/L。根据CLSI推荐的MIC折点和解释[8]，所有菌株均对美罗培南100%耐药，对阿米卡星、左氧氟沙星、替加环素和多黏菌素E的耐药率分别为83%、76%、2%和0；所有菌株均对多黏菌素E敏感，92%的鲍曼不动杆菌对替加环素敏感。见表1。

2.2 头孢哌酮-舒巴坦与其他抗菌药物联合的体外抗菌活性

头孢哌酮-舒巴坦与多黏菌素E联合后对44%和53%菌株呈协同和相加作用，仅对3%菌株呈无关作用。在头孢哌酮-舒巴坦与美罗培南的联合中21% 的菌株呈现协同作用，呈相加作用和无关作用的菌株分别为72%和7%。头孢哌酮-舒巴坦与替加环素、利福平、左氧氟沙星和阿米卡星联合时呈相加作用的菌株分别为49%、65%、68%和75%，均高于呈协同作用的菌株（分别为4%、13%、5%和8%）。47%的菌株对头孢哌酮-舒巴坦与替加环素联合呈无关作用，是所有联合抗菌药物中最多的。头孢哌酮-舒巴坦与所有6种抗菌药物联合均未发现拮抗现象。见表2。

表2 头孢哌酮-舒巴坦体外联合抗菌药物对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌药敏试验协同结果Table 2 Antimicrobial synergy testing of cefoperazone-sulbactam in combination with other antimicrobial agents against carbapenem-resistant A. baumannii

头孢哌酮-舒巴坦（2∶1）与多黏菌素E等6种抗菌药物联合药敏试验结果显示，除替加环素外的抗菌药物联合对受试菌株的MIC值均较各个单药的MIC值低，例如，头孢哌酮-舒巴坦对100株细菌的单药MIC值的范围为16～256 mg/L，MIC90值为256 mg/L，头孢哌酮-舒巴坦与多黏菌素E联合后的MIC值范围和MIC90值，分别为2～128 mg/L和64 mg/L ；多黏菌素E单药的MIC值范围为≤0.06～1 mg/L，MIC90值为0.5 mg/L， 与头孢哌酮-舒巴坦联合后MIC值的范围和MIC90值分别为0.015～0.25 mg/L和0.125 mg/L；两药联合后的MIC90值均下降为原来的1/4。头孢哌酮-舒巴坦与其他抗菌药物联合的效果有同样趋势。见表2。

3 讨论

对于碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染患者，人们常将多黏菌素E、碳青霉烯类药物、替加环素、氨基糖苷类药物和氟喹诺酮类药物单独使用，或将其与头孢哌酮-舒巴坦或其他抗菌药物联合使用来进行治疗[9-12]。在中国，头孢哌酮-舒巴坦是一种常用的β内酰胺酶抑制剂复方制剂。相关研究显示，舒巴坦能够通过与鲍曼不动杆菌青霉素结合蛋白PBP2结合，发挥其抗不动杆菌的活性[13]。 研究还表明，头孢哌酮-舒巴坦对鲍曼不动杆菌具有良好抗菌活性，并可与替加环素、米诺环素、碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素等联合使用[14-15]。

本组资料显示，头孢哌酮-舒巴坦联合多黏菌素E、美罗培南等6种抗菌药物对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌均有良好的体外协同和相加等抗菌作用。其中以与多黏菌素E联合最为显著。该两药联合呈现协同和相加作用的菌株共97%，呈无关作用的菌株仅3%。其次为头孢哌酮-舒巴坦与美罗培南联合，虽然呈协同作用的菌株仅为21%，但有72%的菌株呈相加作用，呈无关作用的菌株仅7%。头孢哌酮-舒巴坦与多黏菌素E或美罗培南的联合均显示，联合后MIC90值仅为单药时MIC90值的1/4，提示头孢哌酮-舒巴坦与多黏菌素E或美罗培南的联合可使药物抗菌活性增加4倍，此结果与Karaoglan等[16]和Kiratisin等[6]的研究结果一致。头孢哌酮-舒巴坦与阿米卡星、利福平、左氧氟沙星和替加环素等其他4种药的联合也均有类似抗菌活性增强的趋势。虽然头孢哌酮-舒巴坦与替加环素联合具有协同作用的菌株仅4%，但49%的菌株具有相加作用，另有47%的菌株呈现无关作用。此外，头孢哌酮-舒巴坦与6种抗菌药物联合均未有拮抗现象发生，此结果为临床选择合适的抗鲍曼不动杆菌感染的治疗方案提供了重要实验室参考依据。

本研究采用肉汤微量稀释棋盘法进行头孢哌酮-舒巴坦联合6种抗菌药物的联合药敏试验，此方法设计的原理和基础是CLSI M07文件中肉汤微量稀释法。在抗菌药物微量板制板操作时需注意以下关键环节：①因是抗菌药物的“联合”药敏试验，故联合受试的抗菌药物工作液的浓度均应为“双倍”；②抗菌药物单药和联合工作区均应包含在同一块微量板上；③因是“棋盘法”药敏试验，微孔板内抗菌药物联合工作区必须保证涉及的2种抗菌药物测试浓度均应严格一一配对，不能发生缺失和错误；④必须留有受试菌的生长对照孔，其他均严格遵守了 CLSI M07中关于肉汤稀释法的要求。通过此法既可以了解抗菌药物单药的MIC值，又可以了解抗菌药物联合后的MIC值。通过计算最终还可以了解两药的联合指数FIC，以及预测两药联合可能发生的“协同” “相加” “无关” “拮抗”作用，报告临床，达到合理选药治疗。此法操作虽较为繁琐，但在目前耐药菌感染肆虐又无合适抗菌药物可用的情况下，仍不失为支持抗菌药物合理用药的药敏试验方法，建议临床微生物室考虑增设。

综上所述，头孢哌酮-舒巴坦与多黏菌素E、美罗培南或替加环素等6种抗菌药物联合，其体外协同抗菌活性对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染的抗菌治疗具有重要临床价值。本研究显示的头孢哌酮-舒巴坦与多黏菌素E等6种抗菌药物的联合作用还需进一步采用时间-杀菌曲线等方法，来动态监测和观察这种“协同”和 “相加”作用，以帮助临床合理选用抗菌药物。