AOAO工艺处理焦化废水的性能及微生物演替规律

张璇，蒋伟勤，罗玲，刘新钱，韦东敏，周超，郭立

(1.广西大学 土木建筑工程学院，广西 南宁 530004；2.柳州工学院 设计艺术学院，广西 柳州 545616；3.广西柳州钢铁集团焦化厂，广西 柳州 545002；4.宝武水务科技有限公司，上海 201900)

据不完全统计，中国每年有超过2.5亿t的焦化废水产生[1]，而其中所包含的氨、酚、氰化物和多环芳烃等多种有毒污染物，让其成为了最难处理的废水之一[2]。近年来，国内外科研人员开发出了O/H/O(好氧-水解-好氧)、A/A/O/O(厌氧-缺氧-好氧-好氧)和A/O/A/O(缺氧-好氧-缺氧-好氧)等几种各具特点的生物工艺，使焦化废水处理降本增效非常明显[3-5]。其中，AOAO工艺因为具有较高的脱氮和解毒能力，受到了广泛的关注。本研究通过监测AOAO工艺中焦化废水理化性能参数的变化，并结合宏基因组测序分析AOAO系统微生物演替规律，为焦化废水处理系统污染物控制策略的开发提供科学依据。

1 实验部分

1.1 全规模焦化废水处理系统

广西柳州钢铁集团有限公司于2019年完成了焦化厂原有单极AO废水处理系统的提质改造，新增了第二级AO处理装置。升级后的焦化废水处理系统已稳定运行近3年，每天可处理焦化废水水量160～180 m3/h。系统工艺流程见图1。原混合废水先经过除油池、调节池等预处理后，被回流水稀释以减少对微生物的毒性作用，之后进入AOAO生物处理系统。根据实际运行效果和前期研究[6]，一级污泥回流比设定为180%～200%，回流水占进水比为120%～150%，二级污泥回流比130%～150%。生物处理后经混凝沉淀物化处理，出水水质符合我国焦化行业执行的《炼焦化学工业污染物排放标准》(GB 16171—2012)。

1.2 理化性质的检测

2021年6月，在柳钢集团焦化厂相关人员的帮助下，每天早、中、晚连续采集生化反应器进水及AOAO反应器出水废水样品，监测理化性质。化学需氧量(HJ 828—2017)、氨氮(HJ 535—2009)、总氮(HJ 636—2012)、硝酸盐氮(《水和废水监测分析方法》第3版)[7]、亚硝酸盐氮(GB 7493—87)、氰化物(HJ 484—2009)、挥发酚(HJ 503—2009)和硫化物(GB/T 16489—1996)采用各自的标准方法进行测量。通过三价铁络合分光光度法测定硫氰酸盐含量。采用PHS-3C酸度计测量废水的pH值。使用二氯甲烷萃取焦化废水中多环芳烃，萃取液通过CNW Florisil固相萃取柱净化，用二氯甲烷和正己烷的混合溶剂(1∶1)洗脱，洗脱液旋蒸浓缩后，用Agilent，7890B—5977B气相色谱-质谱(GC-MS)检测。

1.3 DNA提取和微生物测序分析

焦化废水样品于2021年6月分别从生物反应器A1、O1、A2和O2中采集1次，在提取DNA前储存于-20 ℃的低温冰箱中。DNA提取是通过使用Omega Bio-tek DNA试剂盒进行的。使用TBS-380微型荧光计检测DNA样品的浓度，纯度则由NanoDrop 2000分光光度计测试。利用琼脂糖凝胶电泳(浓度为1%)检测抽提的DNA完整性。通过Covaris M220超声破碎仪将DNA片段化，筛选出400 bp左右的片段，用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq试剂盒构建PE文库，随后在Illumina NovaSeq平台上进行宏基因组测序。获得测序数据采用与Speth相同的方法进行质控、组装、比对等分析工作[8]。

1.4 统计分析

实验收集的数据通过Microsoft Excel 2016和SPSS 26.0进行统计分析。理化指标表示为平均值加减标准差。生物信息学相关比对分析在美吉云平台上进行。

2 结果与讨论

2.1 AOAO工艺的理化特性

通过考察AOAO生物处理过程中化学需氧量、总氮、挥发酚和多环芳烃等11项焦化废水理化指标的变化(表1)，研究了AOAO工艺的运行性能。

表1 AOAO处理系统中焦化废水的理化性质

2.1.1 COD去除性能 生物反应器进水的COD为(4 601±385)mg/L，O1出水和O2出水的COD分别为(635±98)mg/L和(244±25)mg/L，一级AO和二级AO的平均COD去除率分别为86.2%和61.6%。高去除率表明生物处理在COD去除中发挥了重要作用。两级AO具有足够长的水力停留时间(>150 h)，保证了大多数可生物降解有机物的高效去除。O2中残留的有机物来自焦化废水中的有毒大分子有机物或惰性有机物。生物处理阶段出水COD通常在200～300 mg/L，出水仍含有相对较高的难降解有机污染物。因此，残余COD利用后续物化处理工艺进一步去除。

2.1.3 有毒污染物的去除性能 挥发酚是焦化废水中的一类主要污染物，包括苯酚、甲酚、二甲酚和硝基酚等高毒物质。其中苯酚是最丰富的挥发酚，占比50%以上。进水挥发酚浓度为(740±68)mg/L，A1O1的挥发酚去除率高达99.9%，O2出水平均值仅 0.04 mg/L，远低于0.30 mg/L的国标(GB 16171—2012)限值。在A1中，缺氧微生物可直接或间接利用废水中的苯酚、对甲酚等作为内部碳源和能源，实现酚类化合物的高效降解。此前有报道称，采用序批式反应器(SBR)处理含苯酚400 mg/L的合成废水时，观察到苯酚可以在不抑制COD和氨氮降解的情况下几乎被完全去除(生物降解率99%)[10]。与一级AO相比，流入A2O2反应器之前，氰化物、硫化物和硫氰酸盐的浓度显著降低。氰化物对大多数微生物来说是一种已被证实的毒素[11]。90.9%以上的氰化物在一级AO中被去除，从而降低了对二级AO的毒性负荷，毒性的降低又会促进A2和O2中顽固有机污染物降解细菌的增殖。

多环芳烃(PAHs)作为焦化废水中优先控制的持久性有机污染物，进水的总浓度高达(1 453±122)μg/L。O1和O2出水中PAHs的总浓度分别降至(516±67)μg/L和(40±8)μg/L，平均去除率分别为64.5%和92.2%。经过AOAO处理后出水的PAHs平均浓度低于中国和欧盟的排放标准限值(0.05 mg/L)。这表明生物强化两级AO工艺在降解焦化废水PAHs方面，表现出良好的去除性能。虽然PAHs可能经历吸附、挥发、光解和化学降解，但微生物降解是主要的降解形式。生物降解速率取决于温度、pH值、氧气、营养物质可及性、微生物种群和细胞运输特性等因素[12]。PAHs的生物降解在缺氧和好氧条件下都能被观察到。在缺氧环境中，PAHs可在硝酸盐和硫酸盐还原条件下部分降解，形成低分子量有机酸作为配体与重金属发生络合反应，最终还原菌可利用活化的重金属并达到强化降解PAHs的目的[13]。在好氧环境中，微生物通过两种途径降解PAHs。一种是真菌在其胞内单加氧酶作用下进行，另一种是细菌在双加氧酶作用下逐步完成。初始阶段都是依靠加氧酶的作用把氧原子加到碳链上，再经过加氢、脱水等作用使烃链断开，苯环数减少[14]。加氧酶同时能被其他底物(如添加的碳源)诱导，活性提高而使降解作用增强。不同的途径产生不同的代谢物，这些物质通过降解都能被微生物(包括真菌和细菌)利用合成细胞蛋白，最后产物是CO2和H2O[15]。

2.2 AOAO工艺中微生物群落的演变

为了了解生物反应器AOAO中的微生物群落演替规律，分别在门、纲和属水平上分析了分类操作单元(OTUs)的数量。

2.2.1 细菌群落门水平分析 由图2可知，焦化废水中五个最具优势的门依次是Proteobacteria(变形菌门，平均占比62.3%，每个反应器55.8%～80.5%)、Bacteroidetes(拟杆菌门，平均占比18.2%)、Ignavibacteriae(懒杆菌门，平均占比4.41%)、Nitrospirae(硝化螺旋菌门，平均占比3.38%)和Acidobacteria(酸杆菌门，平均占比2.41%)，它们在四个不同的生物反应器中总占比将近90%。这与之前的研究一致，即Proteobacteria和Bacteroidetes是不同焦化废水厂污水或污泥样本中最丰富的两大细菌门[16-17]。据报道，Proteobacteria在焦化废水中主要参与难降解有机化合物(如苯酚、多环芳烃和含氮杂环化合物)的脱氮和生物降解[18]。Bacteroidetes广泛参与蛋白质、纤维素和聚合碳水化合物的降解[19]。Ignavibacteriae处于O1有氧环境时，所占比例从0.96%提升至4.78%，部分优势菌能够进行有氧呼吸，能以氧化方式分解糖类等碳源作为能量来源。Nitrospirae也生活在有氧的环境中，以氧作为最终电子受体，主要功能是保证硝化作用的正常进行。Acidobacteria一般具有较强的代谢碳水化合物能力，即使在偏碱性的焦化废水中始终占有一定的比例。

图2 焦化废水中细菌群落百分比饼图(门水平)Fig.2 Percentages of bacterial community in coking wastewater (phylum level)

2.2.2 细菌群落纲水平分析 在纲水平上，Betaproteobacteria(β-变形菌纲)在四个反应器中均是最大的类别，其包括很多好氧或兼性细菌，所占百分比从26.4%到61.1%。β-变形菌具有突出的降解多种污染物的能力，除了广泛分布于焦化废水生物反应器中，在含酚废水、生活污水等生物处理系统中也被大量检测到[20-21]。变形菌门的另两个菌纲，Alphaproteobacteria(α-变形菌纲)和Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)也具有明显优势，平均占比分列二、四位，分别为13.2%和6.34%，同时它们也是其他工业废水处理系统的主要菌纲[22]。第三大类Flavobacteria(黄杆菌纲)很早就被报道有能力分解多环高分子有机物，如木质素及其衍生物[23]。还有研究发现Flavobacteriumsp.在氮源和硫源充足的条件下，能表现出很高的脱色活性，说明Flavobacteria可能在焦化废水的生物降解脱色中发挥着积极作用[24]。

2.2.3 细菌群落属水平分析 在属水平上，AOAO共检测到3 993个OTUs。利用Venn图分析不同反应器的物种分布情况，由图3可知，四个反应器被检测到的OTUs数量有所差别。O1最小为3 444，在A2中由于碳源的加入，微生物营养供给充足，OTUs数显著增至最大值3 623，可见A2的细菌群落最丰富。总体来看，二级AO细菌群落丰富度高于一级AO。所有样品中共有3 043个相同的OTUs样本，占总数的76.2%，说明不同生物反应器的细菌群落组成较一致。A1中有169个特有OTUs，O1有35个，而A2、O2独有的属只有19和23个，表明细菌群落多样性随着生物反应进程而显著降低，二级AO逐渐形成了一个稳定的微生物群落结构，这有利于AOAO工艺保持长期稳定的运行性能。

图3 细菌OTUs分布Venn图(属水平)

AOAO过程的优势菌属，它们的出现率和比例在一级AO与二级AO中是不一致的。Diaphorobacter(硝基黄杆菌属)在A1O1中占有绝对优势(A1：12.82%，O1：7.38%)。Diaphorobacter对有毒有机污染物，尤其是酚类化合物和多环芳烃，能够进行高效的生物降解[25]。另一优势菌Acidovorax(食酸菌属，A1：7.12%，O1：3.65%)被报道具有氧化砷、溶解铜的能力[26-27]。一级AO偏中性的pH环境有助于富集Acidovorax，进而有利于焦化废水中重金属的转化去除。Han等通过促进Acidovorax细胞内外的电子转移，从而促进其代谢，增强有机物和类蛋白质等营养物质的降解[28]。值得注意的是，A1O1优势菌种之间的差异性明显大于A2O2。A1中突出的Thauera(陶厄氏菌属)百分比达10.05%，O1中则是Thiobacillus(硫杆菌属：6.77%)占优。相比之下，A2O2优势菌属分布较一致，占比较大的同为Hyphomicrobium(生丝微菌属，A2：6.87%，O2：7.40%)和Nitrospira(硝化螺旋菌属，A2：2.69%，O2：2.65%)。

具体来看，在先前的研究中，Thauera已被确定为焦化废水中的主要兼性脱氮菌，其可以利用碳源(如芳烃、酚类或甲醇)作为电子供体完成反硝化反应[29]。毛跃建从反硝化池样品中分离出三株Thauera菌株，发现它们可以降解吲哚、苯酚、甲酚及二甲酚等多种有机污染物[30]。丰富的Thiobacillus被认为是含酚废水的特征，尤其是在焦化废水处理系统中普遍存在[31]。Thiobacillus不仅具有降解苯酚的能力，还负责硫氰化物的生物降解。本研究一级AO对焦化废水中硫氰酸盐的去除率高达96.7%，这可能归功于O1的优势菌属Thiobacillus。特别关注到，Hyphomicrobium在A2O2中的平均丰度为7.14%，远高于一级AO。Hyphomicrobium可以利用甲醇、甲胺等C1化合物作碳源和能源，通常被认为是以甲醇为碳源的反硝化系统的主要参与者[32]。这表明Hyphomicrobium对二级AO反硝化脱氮过程有重要的促进作用。在A1O1中，氨的消耗量很大，硝酸盐在O1中积累，Nitrospira开始富集。Nitrospira是焦化废水硝化过程中最主要的亚硝酸盐氧化菌[29]。二级AO中及时补充碳源，维持Nitrospira的生长繁殖，使Nitrospira的分布优势继续保持，更有利于硝化过程，最终提升总氮的去除率。

3 结论

(1)AOAO工艺具有突出的脱氮和去除有毒污染物的性能。经过AOAO生物处理，焦化废水中挥发酚、总氮和多环芳烃的浓度均小于国家标准(GB 16171—2012)排放限值。

(2)在AOAO处理过程中，优势菌属Diaphorobacter和Thiobacillus等表现出良好的降解多种污染物的能力；Nitrospira、Thauera和Hyphomicrobium等功能微生物在脱氮中发挥着重要作用。

(3)二级AO细菌群落丰富度升高而多样性降低，这有利于AOAO工艺处理系统保持长期稳定的运行性能。