柚皮素治疗结直肠癌的网络药理学分析及实验验证*

张子函，李文鑫，罗香蓉，熊祖明，林益镕，张 森

（广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科，南宁 530021）

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在2021年美国男性及女性的新发癌症中均排在第3 位，在致死的恶性肿瘤中也排在第3 位[1]。早期结直肠癌主要通过手术来达到治疗目的，但是一旦进展到晚期则主要通过化疗与靶向治疗使疾病缓解。但部分患者对目前临床广泛使用的化疗药产生耐药，迫切需要研发新的治疗药物。柚皮素是一种广泛存在于柑橘类水果中的黄酮成分，先前的研究已经证实，柚皮素具有一定的抗肿瘤作用[2-3]。但是柚皮素是否具有抗结直肠癌肿瘤的作用以及其可能的作用机制尚未见相关报道。本文运用网络药理学的方法探究柚皮素作用于结直肠癌产生的作用及其机制，并通过实验进一步验证柚皮素对结直肠癌细胞的抑制作用及核心基因表达的改变。

1 材料与方法

1.1 筛选柚皮素的作用靶点

柚皮素是在许多植物中都存在的化合物，在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索柚皮素（naringenin），保存它的3D 格式并上传至pharmmapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库中得到柚皮素的主要药效团和其作用的靶点。同时利用SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库获得柚皮素的靶点基因，两者取交集获得最终作用靶点。

1.2 筛选结直肠癌的作用靶点

使用GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/），以“colorectal cancer”为关键词检索结直肠癌的作用靶点。同时使用DisGeNet 数据库（https://www.disgenet.org/），以“colorectal cancer”为关键词检索结直肠癌的作用靶点。将两个数据库获得的结直肠癌作用靶点合并后删除重复项，获得结直肠癌作用的最终靶点。

1.3 柚皮素治疗结直肠癌的靶点

使用微生信在线网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）中的jvenn 工具得到柚皮素作用靶点与结直肠癌靶点的交集，即柚皮素治疗结直肠癌的作用靶点。

1.4 蛋白质—蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将获得的柚皮素治疗结直肠癌的作用靶点上传至STRING（https://string-db.org/）数据库，选择物种为“homo sapiens”得到PPI相互作用网络，下载其TSV格式。经过处理后将数据导入Cytoscape中，并利用cytoHubba找到柚皮素作用于结直肠癌的核心基因。

1.5 KEGG通路富集分析和GO富集分析

利用DAVID 在线数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对之前获得的可能作用靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析。再使用R包ggpolt2分别绘制P值最小的20 个分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）、生物过程（biological process，BP）以及20条KEGG通路的条形图。

1.6 实验验证

1.6.1 CCK-8 检测柚皮素对结直肠癌细胞的作用

柚皮素购自上海源叶生物公司（货号：B21596-20 mg）取对数生长期的结直肠癌HCT116细胞，将细胞密度调整为5×104个/mL，接种于96 孔板中，每孔100 μL。在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h后，吸出培养基，每孔加入含有不同浓度柚皮素的新鲜培养基100 μL，浓度梯度为：0.1%DMSO、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L。分别在37 ℃5% CO2的培养箱中培养24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL的CCK-8试剂混匀后在培养箱中放置90 min，用酶标仪检测450 nm波长时的吸光度并计算柚皮素对结直肠癌细胞增殖的抑制作用并绘制折线图。

1.6.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测核心基因的mRNA 表达水平 柚皮素作用48 h 后各孔加入600 μL Trizol 裂解后提取总RNA，之后逆转录成cDNA 进 行PCR 扩增。反 应体系 为：cDNA 模 板2 μL，正向引物0.8 μL，反向引物0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqII 10 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件为：95 ℃，30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s重复45个循环。引物序列为：PIK3CA：上游：5’-CGGTGACTGTGTGGGACTTATTGAG-3’，下游：5’-TGTAGTGTGTGGCTGTTGAACTGC-3’；MET：上 游：ATCAGGAGGTGTTTGGAAAGAT-3’，下游：5’-CGACTGTATGTCAGCAGTATGA；ARK1C3-3’：上游：5’-AAGCTTTGGTCCACTTTTCATC-3’，下 游：5’-GGTCAACATAGTCCAATTGAGC-3’；HSD17B2：上游：5’-CTCGTTAGCCAGCAAGGACTTCTC-3’，下 游：5’-AGCAAGGCAGATCCACAAGTAAGC-3’；SNCA：上 游：5’-GACCAAAGAGCAAGTGACAAAT-3’，下游：5’-CAGAAGGCATTTCATAAGCCTC-3’；SRC：上游：5’-GGAGTGGTATTTTGGCAAGATC-3’，下 游：5’-GATCTTGTAGTGCTTCACGTTG-3’；ESR1：上游：5’-CCTCCTCATCCTCTCCCACATCAG-3’，下 游：5’-GCATCTCCAGCAGCAGGTCATAG-3’。实时荧光定量PCR的结果用相对定量法用2-ΔΔCT值来表示。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 软件进行绘图与统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 柚皮素的潜在作用靶点预测

将通过PubChem获得的柚皮素3D结构上传至pharmmapper 后获得柚皮素作用的靶点，共70 个。同时通过SwissTargetPrediction 获得100 个柚皮素的作用靶点。删除重复项后，总共获得169 个柚皮素作用靶点。

2.2 结直肠癌的靶点预测及共同靶点筛选

在GenCards 数据库中检索得到结直肠癌的10 422 个相关靶点，在DisGeNet 数据库中得到5 473 个结直肠癌相关靶点，删除重复项后共获得11 247 个结直肠癌相关靶点。通过jvenn 工具绘制维恩图（图1），得到141 个交集靶点，即柚皮素治疗结直肠癌可能的作用靶点。

图1 柚皮素作用靶点与结直肠癌相关基因交集

2.3 PPI网络分析及核心靶点预测

在STRING数据库中导入之前获得的141个交集靶点，得到蛋白质相互作用网络（图2）。之后在CytoScape 中获取柚皮素作用于结直肠癌的核心基因，即SRC、CBL、PIK3CA、SYK、LCK、VEGFA、HCK、KDR、SNCA、AKR1C3、HSD17B1、HSD17B2、CYP3A4、CYP19A1、PIK3CB、MET、IGF1R、ESR1、INSR、VAV3（图3）。

图2 柚皮素作用于结直肠癌的核心基因

图3 PPI网络

2.4 GO生物功能分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID 数据库对之前获得的柚皮素可能作用于结直肠癌的141 个交集靶点进行GO 生物功能分析和KEGG通路富集分析，获得靶基因参与的信号通路和生物学过程。GO功能富集分析结果显示，CC集中于细胞膜、血小板、肥大颗粒细胞、转移酶复合物等（图4A）。MF 主要集中于碳酸盐脱水酶、蛋白酪氨酸激酶、水解酶等多种酶的活性，以及类固醇激素受体活性，类固醇结合，核受体、配体激活转录因子活性，激素结合等（图4B）。BP 主要集中于蛋白质自磷酸化，肽基酪氨酸的磷酸化及修饰，对淀粉样蛋白-β的反应，对类固醇激素的反应，MAP 激酶活性的正相关性及活性，异生物代谢过程，生殖结构与系统发育等（图4C）。KEGG通路富集分析结果显示，内分泌抵抗（endocrine resistance）、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、前列腺癌（prostate cancer）、Ras 信号通路（ras signaling pathway）、花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、Rap1 信号通路（Rap1 signaling pathway）、化学致癌作用—受体激活（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、粘着力（focal adhesion），膀胱癌（bladder cancer）、脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、催乳素信号通路（prolactin signaling pathway）、卵巢类固醇生成（ovarian steroidogenesis）、乳腺癌（breast cancer）、黑色素瘤（breast cancer）、非小细胞肺癌（Nonsmall cell lung cancer）、亚油酸代谢（linoleic acid metabolism）等是柚皮素的主要作用通路（图4D）。由此可见，柚皮素对于结直肠癌可能具有一定的抑制作用。

图4 GO分析和KEGG通路富集分析

2.5 实验验证

2.5.1 CCK-8 检测柚皮素对结直肠癌细胞的抑制作用 在柚皮素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L时，24 h的抑制率分别为6.12%、11.37%、26.16%、59.78%、81.43%；48 h 的抑制率分别为15.01%、30.37%、45.04%、85.50%、87.61%；72 h 的抑制率分别为14.35%、47.31%、69.28%、93.26%、91.03%。随着柚皮素浓度的上升和作用时间的延长，柚皮素对结直肠癌的抑制作用逐渐增强（P＜0.05），见图5。

图5 柚皮素对结直肠HCT116细胞增殖的抑制作用

2.5.2 RT-qPCR检测核心基因的mRNA表达水平

给予200 μmol/L的柚皮素之后,与对照组相比，柚皮素处理过的细胞内PIK3CA、MET、HSD17B2、SNCA、SRC、ESR1mRNA 表达水平降低（P＜0.05）；而ARK1C3mRNA 表达水平升高（P＜0.05），见图6。

图6 柚皮素对核心基因mRNA表达水平的影响

3 讨论

有研究认为陈皮、半夏、草豆蔻、甘草中的主要抗肿瘤成分为柚皮素[4-6]。柚皮素是天然二氢黄酮类化合物，研究显示其可通过抑制细胞增殖而发挥抗肿瘤作用，如在HepG2肝癌细胞和人胎盘绒毛膜癌中[7-8]。同时，它也可通过诱导HepG2 肝癌细胞、胰腺癌等细胞凋亡而抑制肿瘤生长[7，9]。柚皮素还可以抑制肿瘤细胞的侵袭迁移，如在神经胶质瘤细胞[2]、乳腺癌细胞[10]和前列腺癌细胞中[3]。但柚皮素在结直肠癌中发挥的抗肿瘤作用及其机制目前的研究相对较少。

通过网络药理学分析显示，PIK3CA、SRC、HSD17B2、SNCA、CYP19A1、PIK3CB、INSR、MET、ESR1、ARK1C3等为柚皮素治疗结直肠癌的核心基因。其中，SRC在超过80%的结直肠癌患者中异常过度表达和激活，柚皮素作用于SRC基因就可能发挥其抗结直肠肿瘤作用[11]。MET 也称为肝细胞生长因子受体，是一种酪氨酸激酶，被认为是结直肠癌早期侵袭和转移的重要因素，可作为重要的预后指标[12]。研究显示，激活MET可以诱导结直肠癌细胞的侵袭和转移[12]，同时，MET 也参与了癌细胞的免疫逃逸[13]。提示柚皮素可能通过作用于MET 基因抑制结直肠癌的转移，改善患者预后。另有研究显示，ESR1 的表达与结直肠癌细胞对五氟尿嘧啶的敏感性呈负相关[14]，柚皮素降低ESR1的表达可能会增高结直肠癌细胞对于化疗药物的敏感性从而达到更好的治疗效果。SNCA基因被证实与胃肠道肿瘤存在一定的关系[15]，柚皮素作用于这一基因可能对结直肠癌产生一定的影响。

本研究通路富集结果显示，PI3K-Akt信号通路是柚皮素抗结直肠癌可能发挥作用的通路，PIK3CA在结直肠癌组织中的表达高于正常肠上皮组织[16]，PI3K-Akt信号通路与结直肠癌相关，先前的研究证实了PI3K-Akt 信号通路可以作为结直肠癌的治疗靶点[17-18]。同时，柚皮素可作用于催乳素信号通路，卵巢类固醇生成信号通路，乳腺癌信号通路，而这些通路都与体内雌激素相关。柚皮素可能通过作用于雌激素受体而发挥抗结直肠癌的作用。而花生四烯酸代谢、亚油酸代谢通路是体内的脂代谢通路，柚皮素也可能通过改变脂肪组织而发挥抗结直肠癌的作用。

CCK-8实验显示，柚皮素对结直肠癌细胞的生长具有抑制作用。同时RT-qPCR实验显示，结直肠癌细胞经过柚皮素处理后核心基因PIK3CA、SRC、HSD17B2、MET、ESR1和ARK1C3的表达量会发生显著性改变，进一步表明柚皮素通过靶向这些基因产生抗结直肠癌作用。

本研究通过网络药理学的方法，预测了柚皮素的抗结直肠癌作用及其可能的作用机制，通过实验验证了柚皮素对结直肠癌细胞具有抑制作用并使核心基因在结直肠癌细胞中的表达情况改变，可为后续柚皮素治疗结直肠癌的进一步研究提供理论依据。