氨基酸处理对水培韭菜产量、品质及风味的影响

韩贝贝 王宝驹 佟 静 刘明池 武占会 孟艳玲 刘 宁*

〔1 河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸 056038；2 农业农村部都市农业（北方）重点实验室，北京市农林科学院蔬菜研究所，北京 100097；3 国家蔬菜工程技术研究中心，北京市农林科学院，北京100097〕

韭 菜（Rottl.ex Spreng.）是石蒜科（Amaryllidaceae）葱属的多年生宿根蔬菜（Saito，1990；李延龙 等，2020）。韭菜起源于我国华北地区，栽培历史悠久，全国各地均有分布，常年种植面积达40 万hm以上，在蔬菜生产和周年供应中占据重要地位（王娟娟 等，2020）。近年来，水培韭菜技术的出现在一定程度上缓解了长期困扰韭菜产业的农残超标和病虫害问题，但与传统土壤栽培韭菜相比，水培韭菜的风味稍逊一筹，其原因在于风味物质积累量不足（Liu et al.，2021）。因此，如何通过栽培技术创新提升水培韭菜的风味，成为当前水培韭菜产业的核心问题之一。

韭菜叶片含有丰富的有机硫化合物S-烃基半胱氨酸亚砜〔S-alk（en）yl cysteine sulfoxide，CSO〕，这类风味前体物质构成了韭菜特征香气和医疗保健功效的主要物质基础（Liu et al.，2021）。同位素示踪研究证实硫酸盐首先同化生成半胱氨酸（Takahashi，2010，2019），经过多步生化反应形成谷胱甘肽及其衍生物（Galant et al.，2011），如S-甲基谷胱甘肽、S-（2-羧丙基）-谷胱甘肽等，继而生成γ-谷氨酰胺-S-烯丙基半胱氨酸、γ-谷氨酰胺-S-丙烯基半胱氨酸、γ-谷氨酰胺-S-甲基半胱氨酸等一系列γ-谷氨酰胺肽衍生物，最终经依赖黄素的单加氧酶（FMO）催化的硫氧化（S-oxygenation）反应，生成不同的CSO 分子（Jones et al.，2004）。FMO 负责催化立体选择性较高的硫单加氧反应，因而该过程可能是CSO 合成限速反应（Yoshimoto et al.，2015）。在加工韭菜叶片时，CSO 经蒜氨酸酶催化水解和随后的自发降解反应，生成一系列具有刺激性气味的挥发性有机硫化物，释放出葱属蔬菜的特征香气（Yoshimoto &Saito，2019）。研究表明，丝氨酸直接参与半胱氨酸的合成过程，缬氨酸是CSO 合成的中间产物γ-谷氨酰胺-S-（2-羧丙基）-半胱氨酸的反应底物，谷氨酸是谷胱甘肽的合成起始底物之一，因而这些氨基酸在CSO 生物合成过程中起着重要作用（Jones et al.，2004，Liu et al.，2021）。综上所述，CSO 生物合成过程至少涉及缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸参与的生化反应过程，而FMO 在韭菜CSO合成过程中起着至关重要的作用（Rabinowitch &Currah，2002；Jones et al.，2004；Yoshimoto et al.，2015）。

氨基酸作为一种有机氮源可以被作物直接吸收利用，外源施用氨基酸可以显著提高作物产量、品质以及抗逆性（张连秋 等，2014；Teixeira et al.，2018）。大量研究证实，氨基酸等小分子物质作为水溶肥料，不仅能促进作物生长，还能显著提高茄子、芹菜、豇豆、番茄等蔬菜的品质，作物净光合速率、叶绿素含量、株高、茎粗等指标显著高于对照组（曹洪凤 等，2010；Koukounaras et al.，2013；王军 等，2014；王蓓 等，2017）。目前，氨基酸肥料在韭菜生产中的应用报道较少，因此本试验利用水培韭菜生产系统，以苗龄为3 年的791 韭菜为试验材料，通过向水培营养液中添加CSO 合成相关的4 种氨基酸（缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和谷氨酸），研究它们对水培韭菜生长、产量、品质及风味的影响，以期明确能够促进韭菜CSO 积累，提升水培韭菜风味的氨基酸。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验在北京市农林科学院蔬菜研究所连栋玻璃温室内进行，供试韭菜品种为791。采用新型韭菜水培系统，架床使用72 孔无底栽培格盘（54 cm ×28 cm），营养液使用千叶农式葱配方（杜红艳 等，2015；季延海 等，2017）：Ca（NO）1.0 mmol ·L、KNO4.0 mmol·L、NHNO2.0 mmol·L、KHPO2.0 mmol·L、（NH）SO1.0 mmol·L、MgSO·7HO 1.0 mmol·L。在此配方基础上，参考水培营养液添加氨基酸的试验（Khan et al.，2019），将营养液中氨基酸处理条件分别设定为添加1 mmol·L缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和谷氨酸，以不添加氨基酸的千叶农式葱配方营养液为对照（CK）。试验以3 年生的韭菜为研究材料，每个处理使用3 个栽培格盘的韭菜，设置3 次重复。营养液pH 值控制在6.0 ± 0.3 范围，每周测1 次EC和pH 并及时使用相应的营养液进行补充和更换。试验于2021 年4 月3 日、5 月12 日和6 月19 日分别收获第1、2、3 茬韭菜，第1 茬韭菜采收后开始进行不同氨基酸处理，并在第2 茬采收时测定各项生长、生理及品质指标。

1.2 生长、生理指标的测定

每个处理随机选取10 株韭菜进行测定，设置3 次重复。用电子游标卡尺测定韭菜假茎粗，用直尺测量韭菜株高、叶长、叶宽，观察叶片数。采用乙醇浸提比色法测定韭菜叶片光合色素含量，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定韭菜根系活力（李合生，2000），采用硫酸-蒽酮比色法测定韭菜叶片可溶性糖含量（张以顺 等，2009），采用2，6-二氯酚靛酚钠滴定法测定韭菜叶片VC 含量（蔡庆生，2013），采用考马斯亮蓝G-250 法测定韭菜叶片可溶性蛋白质含量（李合生，2000），采用水杨酸法测定韭菜叶片硝酸盐含量（曹建康 等，2007）。

每个处理随机选取5 株韭菜测定单株干鲜质量，3 次重复。鲜质量直接用分析天平称量，干质量测定在105 ℃杀青，75 ℃烘干至恒重后称重记录。单位面积理论产量是根据收获的3 个水培盘（每盘面积0.151 2 m）内的韭菜产量进行估算，计算公式如下。

理论产量〔kg ·（667 m）〕=单个格盘收获韭菜产量（kg）× 667 m/单个格盘面积

1.3 韭菜辛辣度的测定

韭菜辛辣度测定参考大蒜和洋葱的检测方法，通过测定CSO 水解后酶促丙酮酸的含量，评估葱属作物的辛辣程度（Liu et al.，2021）。每个处理取4～6 株新鲜韭菜叶片中段共0.5 g，混成一个样品放入离心管中，以未添加氨基酸营养液的水培韭菜为CK1，以土壤栽培的韭菜为CK2，3 次重复。在离心管中加入2 mL 含5% TCA 的磷酸缓冲液（pH 6.5），经高通量植物匀浆提取仪研磨成浆，用台式高速冷冻离心机10 000 r·min离心后取上清液，样品组按比例加入10 倍稀释的韭菜组织上清液、0.012 5% 2，4-二硝基甲苯、0.6 mol·L氢氧化钠（比例为3∶1∶5），空白组加入与韭菜组织上清液等体积的蒸馏水，室温反应5 min 后用BioTek 酶标仪进行比色测定吸光值，检测波长为520 nm。利用丙酮酸钠溶液绘制标准曲线，计算韭菜叶片的酶促丙酮酸含量，测定其辛辣度。

1.4 韭菜FMO 基因表达量测定

每个处理取韭菜的第4 片叶，每5 株的叶片材料混成一个样品，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于RNA 提取。使用EasyPure® Plant RNA Kit 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）提取韭菜叶片总RNA，随后用TransScript® II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）进行反转录，合成cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Mater Mix试 剂 盒〔Toyobo（shanghai）Biotech CO.，Ltd.〕进行基因表达分析。qRT-PCR 反应体系为：SYBR Green Mix（2×）10.0 μL、上下游引物（10 μmol ·L）各0.5 μL、cDNA 1.0 μL、补足灭菌ddHO 至20.0 μL；qRT-PCR 反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。试验设置3个生物学重复，选用（）为内参基因，采用2法计算基因相对表达量（Tong et al.，2021）。

1.5 数据分析

使用SPSS 22.0 以Tukey 法进行多重比较，检验数据差异显著性，采用EXCEL 2016 软件分析试验数据并进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同氨基酸处理对韭菜生长的影响

从表1 可以看出水培韭菜营养液添加不同氨基酸后，株高、假茎粗、叶长、叶片数、根系活力等多数指标优于对照，其中以谷氨酸处理的韭菜表现最佳，株高、假茎粗、叶长、叶宽、叶片数和根系活力分别较对照提高了30.6%、47.2%、29.7%、34.8%、16.2%和166.9%，且与对照差异显著。丝氨酸、缬氨酸对水培韭菜生长也有一定的促进作用，而半胱氨酸对韭菜生长影响不大。

表1 不同氨基酸处理对韭菜生长指标的影响

2.2 不同氨基酸处理对韭菜光合色素含量的影响

由表2 可知，缬氨酸、丝氨酸和半胱氨酸处理韭菜的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、叶绿素a+b、叶绿素a/b 等生理指标均与对照差异不显著。但谷氨酸处理的韭菜叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素a+b 含量均显著低于对照，分别较对照降低了41.2%、15.0%、42.8%和38.7%。

表2 不同氨基酸处理对韭菜光合色素含量的影响

2.3 不同氨基酸处理对韭菜品质的影响

由表3 可以看出，谷氨酸处理显著促进了VC积累，韭菜叶片的VC 含量比对照增加50.9%。添加氨基酸处理对韭菜可溶性糖、可溶性蛋白含量影响不大。缬氨酸处理导致叶片硝酸盐含量显著升高，而其他3 种氨基酸对叶片的硝酸盐含量影响不大。

表3 不同氨基酸处理对韭菜品质的影响

2.4 不同氨基酸处理对韭菜干鲜质量和产量的影响

由表4 可知，氨基酸处理对韭菜鲜质量和干质量的影响趋势完全一致。谷氨酸处理能显著促进韭菜单株干、鲜质量增加，分别比对照增加44.4%、42.2%；半胱氨酸处理导致韭菜干、鲜质量显著降低，分别比对照降低43.4%、49.5%。

表4 不同氨基酸处理对韭菜单株干鲜质量和产量的影响

韭菜产量的变化趋势为：谷氨酸＞缬氨酸＞丝氨酸＞对照＞半胱氨酸，其中谷氨酸、缬氨酸处理的产量显著高于对照，分别实现增产41.5%、33.1%，而半胱氨酸处理的产量显著低于对照，比对照降低17.6%。

2.5 不同氨基酸处理的韭菜辛辣度

由图1 可以看出，谷氨酸处理的韭菜酶促丙酮酸含量达4.3 μmol·g（FW），辛辣度较对照提高70.9%，与土壤韭菜辛辣度相近。半胱氨酸和缬氨酸处理也能提高韭菜辛辣度，但与对照差异不显著。

图1 不同氨基酸处理对韭菜辛辣度的影响

2.6 不同氨基酸处理对韭菜FMO 基因表达的影响

为明确氨基酸处理对韭菜FMO 基因表达的影响，本试验利用qPCR 方法研究了已知的6 个韭菜FMO 基因在4 种氨基酸处理条件下的表达情况。试验结果表明，__和__表达不受4 种氨基酸处理的影响，其他4 个韭菜FMO 基因的表达至少响应1 种氨基酸处理（图2）。值得注意的是，与对照相比，谷氨酸处理能促进4 个FMO 基因（__、__、__和__）表达量显著增加，而半胱氨酸仅能显著促进1 个FMO 基因（__）的表达。

图2 4 种氨基酸处理对韭菜FMO 基因表达的影响

3 结论与讨论

水培韭菜的辛辣度不及土壤栽培韭菜，严重影响消费者的购买意愿和农户的种植收益，因此如何通过栽培技术创新提升水培韭菜的风味成为当前一项重要的产业需求。构成韭菜风味的主要成分是一类有机硫化物CSO，其合成过程需要半胱氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸参与，因此笔者在水培韭菜营养液中添加上述4 种氨基酸，研究了它们对韭菜辛辣度及生长、生理指标的影响。

不同作物对氨基酸肥料的需求存在显著差异。李磊等（2019）发现适宜浓度的氨基酸水溶肥作用在辣椒现蕾期时能促进作物生长，辣椒果实的氨基酸含量有所增加，表明植物不仅可以吸收氨基酸，还可以将外源氨基酸转换利用，从而提高植物体内氨基酸含量。张政（2005）以5 种具有代表性的氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸和谷氨酸）进行黄瓜营养效应的试验，结果表明丙氨酸和甘氨酸能显著提高黄瓜的生长指标，而赖氨酸处理下黄瓜干鲜质量甚至低于对照。本试验发现，谷氨酸、丝氨酸和缬氨酸处理能促进水培韭菜生长，其中谷氨酸的促生效果最好，然而半胱氨酸对韭菜生长基本无影响。由此可见，韭菜更倾向利用谷氨酸，在营养液中添加谷氨酸能促进韭菜生长。

本试验发现添加氨基酸对水培韭菜的光合色素合成影响不大，韭菜的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、叶绿素a+b、叶绿素a/b 含量均低于对照或与对照无显著差异。这与前人的研究结果基本一致，如在以硝酸盐为氮源的培养基中，谷氨酸促进了小球藻的生物量但是叶绿素含量没有变化（刘学铭和梁世中，1999）。推测这可能是由于试验添加的4 种氨基酸并不直接参与光合作用代谢途径，因而对光合色素合成过程影响轻微。

根系的生长情况直接影响植株生长特性和肥水吸收能力。本试验中，水培韭菜在添加丝氨酸、谷氨酸和缬氨酸的营养液中根系活力均显著高于对照，反映它们能促进水培韭菜更好生长。同时，添加谷氨酸、缬氨酸使韭菜产量显著提高，其中谷氨酸的增产效果最为显著。因此，结合考虑生长、生理和产量指标，在水培韭菜营养液中添加谷氨酸，有利于改善水培韭菜的生长状况。

外源施用4 种氨基酸对韭菜的营养品质指标影响不大，但能影响韭菜的风味。本试验发现仅谷氨酸处理能显著提高水培韭菜的VC 含量，然而可溶性糖、可溶性蛋白等指标与对照差异不显著，其他3 种氨基酸处理对水培韭菜的营养指标影响轻微；谷氨酸处理能显著提高水培韭菜酶促丙酮酸含量，使水培韭菜变得更为辛辣，这表明谷氨酸能促进CSO 的合成和积累。

为探究氨基酸处理提升水培韭菜风味的机理，进一步分析了CSO 合成关键基因FMO 表达的变化情况。笔者前期在韭菜组织特异性转录组鉴定到6个韭菜叶片组织中丰度较高的韭菜FMO 基因，它们是编码CSO 合成限速反应的一类氧化酶基因（Liu et al.，2021）。qRT-PCR 试验表明，谷氨酸能促进其中4 个FMO 基因的表达，效果明显好于其他3种氨基酸处理，从而更有利于韭菜合成风味物质前体分子，提升韭菜风味。因此综合考虑生长、生理和营养风味指标，在营养液中添加1 mmol·L谷氨酸，能有效改善水培韭菜品质，提高产量，并有效提升其辛辣风味。