具有细胞黏附反差特性的单层平行丝素蛋白纤维图案的制备及其性能

顾张弘， 姚 响， 王锦思， 张耀鹏

(1. 东华大学 纤维材料改性国家重点实验室， 上海 201620； 2. 东华大学 材料科学与工程学院， 上海 201620)

细胞外基质(ECM)中多种重要组分均为纤维状结构，如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白等[1-3]，其为细胞的黏附、生长、迁移和分化等行为提供了重要的生物和物理支撑[4]。纤维状材料因具有仿ECM结构的特征，在生物医学领域具有广阔的应用前景[4-6]。研究细胞-纤维材料的相互作用规律有助于推动新一代生物材料的开发。

静电纺丝具有装置简单、工艺可控等优点，已成为高效制备生物纤维材料的主要途径之一[7-9]。目前，已有研究利用静电纺丝技术，从纤维聚集体层面考察并证实了纤维直径、支架孔径、纤维的单一取向排布与无规则排布等特征能够对细胞的黏附和分化等行为产生明显影响[10-12]。然而，相关研究中均存在明显背景黏附干扰，如细胞透过纤维间空隙与背景基底材料的黏附干扰和细胞跨越周围临近多根纤维间的黏附干扰等。这些背景黏附干扰的存在混杂了多因素对细胞行为的影响，极有可能会干扰纤维自身特征对细胞行为的影响，导致难以准确揭示细胞-纤维相互作用规律。目前，由于缺乏有效的纤维材料平台，鲜有研究报道在完全排除背景黏附干扰的基础上考察纤维特征对细胞行为的影响。

具有细胞黏附反差特性的图案化技术提供了一种独特而强大的工具来了解细胞与材料间的相互作用规律[13-15]，其最大优势便在于能够在排除干扰因素的条件下独立考察材料自身特征对细胞黏附等行为的影响，这对生物材料的开发和发展均具有重要意义[16-18]。本文选用具有良好生物相容性的丝素蛋白(SF)纤维为模型材料，利用寡聚乙二醇硅烷化试剂(MPTES)在玻片表面自组装接枝，制备具有优秀抗细胞黏附特征的基底材料；结合SF湿法纺丝技术在基底表面制备可黏附细胞的单层平行纤维，借助生物相容性良好的聚二甲基硅氧烷将SF纤维两端固定于基底边缘，从而制备具有细胞黏附反差特性的单层平行纤维图案。在此基础上，验证了纤维图案的细胞黏附反差特性。

1 实验部分

1.1 实验材料

家蚕茧，产地浙江桐乡；碳酸钠、溴化锂、甲苯，上海凌峰化学试剂有限公司；透析袋，上海源聚生物科技有限公司；乙醇、浓硫酸、30%过氧化氢，国药集团化学试剂有限公司;寡聚乙二醇硅烷化试剂(乙二醇链段数为6～9，MPTES)，美国Gelest公司；三乙胺，上海强顺化工有限公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)有机硅弹性体双组分套件，美国道康宁公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)，美国Hyclone公司；胰蛋白酶、培养基(低糖DMEM)、澳洲胎牛血清、青链霉素混合液(双抗)，美国Gibco公司；多聚甲醛、FITC标记的鬼笔环肽荧光染料、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(Trition X-100)，美国Sigma公司；玻片(尺寸为23 mm×26 mm)，江苏飞舟玻塑有限公司。

1.2 具有抗细胞黏附特性的玻片基底制备

将MPTES接枝到洁净的玻片表面进行修饰处理，使其具有抑制细胞黏附的功能。具体步骤如下：1)使用浓硫酸和30%过氧化氢按体积比为7∶3配制的食人鱼溶液浸泡洁净的玻片，处理30 min后用超纯水超声波清洗干净，氮气吹干备用；2)将玻片放入DT-01型低温等离子体处理仪，气氛为氧气，在功率为100 W，真空度为30 Pa的条件下处理15 min后取出玻片，立即放入超纯水中浸泡15 min，氮气吹干备用；3)将玻片放入盛有反应液的密闭反应容器中，在氮气氛围保护下反应2 d，反应温度维持在60 ℃左右。反应液中溶剂为甲苯，MPTES浓度为6 mmol/L，催化剂为体积分数为1%的三乙胺。

1.3 SF纺丝液制备

SF湿法纺丝水溶液参照文献[19]制备。首先采用质量分数为0.5%的碳酸钠溶液对家蚕茧脱胶处理30 min；再利用溴化锂(9 mol/L)溶液在40 ℃下溶解脱胶丝，得到质量分数约为10%的SF水溶液；最后，将所得SF溶液经离心、抽滤后透析3 d以除去盐离子，通过低温对流吹风浓缩溶液至33%备用。

1.4 单层平行SF纤维图案的制备

采用湿法纺丝工艺制备了2种直径的单层平行纤维图案。首先，将SF纺丝液经内径为0.41 mm的针头挤出后，经体积分数为90%的乙醇水溶液凝固浴固化，最后卷绕于收集辊。收集辊上固定有接枝MPTES的玻片。实验过程中通过控制纤维沿收集辊的轴向运动来调控纤维间间距。小直径纤维图案的制备参数为喷丝口流量16 μL/min、牵伸速度1.6 cm/s。大直径纤维图案的制备参数为：喷丝口流量30 μL/min、牵伸速度1.2 cm/s。

在基底材料上制备好单层平行排布的纤维材料后，将PDMS预聚物和配套交联剂以10∶1的质量比混合均匀后涂覆于单层平行排列纤维两端与基底结合的部位，随后在70 ℃下交联固化30 min，从而将纤维与基底紧密固定，最终获得具有细胞黏附反差特性的单层平行纤维图案。根据纤维直径大小将2组图案分别命名为小直径(S-SF)纤维图案和大直径(L-SF)纤维图案。纤维图案构成示意图如图1所示。

图1 具有细胞黏附反差特性的单层平行纤维图案组成示意图Fig.1 Schematic diagram to show component of single-layer and parallel arranged fiber pattern with cell adhesion contrast properties

1.5 纤维图案与纤维结构特征表征

将纤维图案样本置于DMi8倒置相差显微镜下进行图像采集以评估纤维的排布、直径及纤维间间距。纤维的直径及间距由Image J软件进行测量分析获得，单个样品选取100处进行测量，取平均值。利用FlexSEM1000Ⅱ扫描电子显微镜(SEM)对纤维形貌进行表征。将制备好的样品干燥后喷金(电流为10 mA，时间为90 s)处理，在10 kV的电压下观察纤维的微观形貌。

利用Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析仪对纤维组成结构进行表征，在4 cm-1分辨率下累计扫描32次，记录4 000～600 cm-1范围内的光谱数据。利用PeakFit软件对酰胺Ⅰ区(1 720～1 580 cm-1)晶型分峰拟合，分别计算2种直径的纤维中β-折叠、β-转角、无规卷曲/螺旋构象的含量。为减小实验误差，测试样品不少于3个，实验结果用平均值±标准差表示，数据采用Origin 9.0中的单因素ANOVA法进行统计学分析，概率值p<0.05表示结果具有显著性差异。

1.6 细胞的传代培养及其在材料上的接种

L929成纤维细胞培养液由低糖DMEM培养基、澳洲胎牛血清、双抗按100∶10∶1的体积比配制。将含有L929成纤维细胞的培养液置于37 ℃、5%CO2含量的细胞培养箱中培养，每2 d全量更换培养液，待细胞长满约培养瓶80%后进行细胞传代。

分别将修饰前后的玻片基底以及单层平行纤维图案置于六孔板中(每孔放置1个图案)，随后利用定制的聚四氟乙烯环将图案压紧固定在六孔板底部。然后将L929成纤维细胞接种到酒精灭菌后的玻片基底和纤维图案材料上，每孔添加2 mL细胞悬浮液，细胞密度为5万个/mL，随后置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，细胞黏附2～3 h后吸弃未黏附的悬浮细胞，每孔加入2 mL的新鲜培养液继续放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.7 细胞在材料上的黏附状态观察

1)细胞在未修饰玻片和修饰玻片基底表面的黏附状态观察。L929成纤维细胞在材料上黏附培养1 d后，用PBS润洗2次，使用4%的多聚甲醛溶液固定细胞15 min；然后用PBS润洗2次后加入0.1%的Triton X-100处理5 min以达到破膜效果；再用PBS润洗2次后加入鬼笔环肽水溶液(质量浓度为1 μg/mL)对细胞骨架染色30 min；继续用PBS润洗2次后加入DAPI染液(质量浓度为10 μg/mL)对细胞核染色5 min；最后经PBS润洗后，将染色样品置于倒置相差显微镜的荧光模式下进行观察。

2)细胞在平行纤维图案上的黏附状态观察。将L929成纤维细胞在纤维图案材料上黏附培养1 d后，置于倒置相差显微镜上观察纤维图案上的细胞黏附情况。为进一步清楚地观察细胞在纤维图案上的黏附状态，随机选取部分样品采用SEM进行观察：将细胞在纤维图案材料上黏附培养1 d后移除培养液，用PBS清洗后将体积分数为2.5%的多聚甲醛溶液加入孔板处理2 h以固定细胞；随后，将固定液移除用PBS润洗3次，以除去残余多聚甲醛；然后依次使用梯度体积分数的乙醇水溶液(体积分数依次为30%、50%、70%、75%、80%、90%和100%)对固定后的样品进行脱水处理，每种体积分数下浸泡10 min；最后，移去乙醇溶液后加入叔丁醇，于-60 ℃冰箱中冷冻过夜后取出，使用冷冻干燥机对样品进行冻干处理，温度为-60 ℃，将冻干样品表面喷金(10 mA，60 s)处理后使用SEM观察细胞黏附特性。

2 结果与讨论

2.1 基底材料抗细胞黏附修饰及功能验证

通常抗细胞黏附功能的实现主要是通过减少蛋白质在基底表面的吸附，有效方法之一便是利用聚乙二醇(PEG)对材料进行合理修饰，例如使用PEG水凝胶或分子链相对较长的寡聚乙二醇单分子自组装层能够表现出优秀的抗细胞黏附功能[18,20-21]。为了获得具有优秀抗细胞黏附特性的基底材料，本文选用MPTES对洁净玻片基底进行接枝修饰，以获得具有抗细胞黏附作用的基底材料。MPTES一端带有硅氧烷基，另一端带有寡聚乙二醇链段。经氧气等离子体处理的玻片基底表面会形成大量羟基，这些羟基在接枝过程中可与MPTES中的硅氧烷基共价结合，进而在洁净玻片基底表面形成一层牢固的寡聚乙二醇单分子层，从而赋予基底材料良好的抗细胞黏附特性。

L929成纤维细胞在未修饰和经MPTES接枝修饰后玻片基底表面接种黏附1 d后的荧光染色照片如图2所示。由图2(a)可以看到，在未修饰的玻片基底表面细胞黏附正常，存在大量的细胞核和明显的细胞骨架。而在接枝修饰后的玻片基底表面则观察不到明显的细胞核和细胞骨架(见图2(b))，仅有极少量细胞黏附且细胞铺展较差，表明经过MPTES接枝修饰后的玻片基底具有优异的抗细胞黏附功能。

图2 细胞在MPTES修饰接枝前后玻片基底表面的黏附情况Fig.2 Cell adhesion on glass surfaces before (a)and after (b)MPTES grafting modification

2.2 单层平行纤维图案的性能分析

SF由于其拥有优异的生物相容性，可控的降解性，优良的加工性等优点，已有多种SF基纤维状支架材料应用于再生医学及组织工程领域[22-24]。在SF的多种成形加工方法中，湿法纺丝技术能够较为简便地获得具有不同直径尺寸的纤维材料[24-26]。本文制备的2种不同直径的纤维图案，如图3所示，相关统计数据见表1。可以看出，纤维材料呈现明显的单层、平行排布特征。基于倒置相差显微镜图像的统计分析得出，2组纤维的平均直径分别约为83和129 μm，说明通过纺丝流量及牵伸速度的改变可以调控纤维直径。此外，为了避免细胞在常规图案间的跨越黏附，图案间的间距需大于70～100 μm[27]，因此，本文调控纤维图案中纤维间的间距均大于100 μm。测量结果表明，S-SF和L-SF纤维图案中纤维间的平均间距分别约为194和160 μm。综上所述，本文成功实现了预设单层平行纤维图案的制备，且纤维直径和间距可调。

图3 2种不同直径单层平行纤维图案的相差显微图像Fig.3 Phase contrast micrographs of single-layer and parallel arranged fiber patterns with different diameters

表1 2种单层平行纤维图案中的纤维直径及纤维间间距统计结果Tab.1 Statistical results of fiber diameter and fiber spacing of single-layer and parallel arranged fiber patterns

材料表面的微纳米结构和软硬程度等因素已被证明能够调控细胞的黏附和生长，进一步影响后期细胞的分化等行为[4]。基于此，本文利用扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱仪分别考察了2种图案中SF纤维的形貌和构象。小直径和大直径纤维图案中对应的纤维形貌照片如图4所示。可见，纤维图案中小直径纤维和大直径纤维的表面均较为光滑,但由于纺丝过程中存在一定的拉伸作用，在2种纤维表面均呈现出了类似的沿纤维拉伸方向取向的沟壑状结构。

图4 不同直径单层平行纤维图案中SF纤维的SEM照片Fig.4 SEM images of SF fibers in single-layer and parallel arranged fiber patterns with different diameters

注：“△”表示单因素ANOVA分析中的概率值 p>0.05，无显著差异。图5 不同直径单层平行纤维图案中SF纤维的红外光谱图和二级结构含量统计结果Fig.5 FT-IR spectrum (a) and statistical results of secondary structure contents (b) of SF fibers in single-layer and parallel arranged fiber patterns

2.3 细胞黏附反差功能分析

结合具有抗细胞黏附特性的基底和可细胞黏附的SF纤维，本文构筑了一种具有细胞黏附反差功能的单层平行SF纤维图案，该图案平台具有在排除各类背景黏附干扰的基础上考察纤维特征对细胞行为影响的潜力。为了验证典型单层平行纤维图案的细胞黏附反差功能，将L929成纤维细胞接种到小直径单层平行纤维图案表面，同时选取基底未经抗细胞黏附修饰的纤维图案作为对照组对比。L929成纤维细胞接种到纤维图案上黏附生长1 d后的相差显微镜照片和SEM照片如图6所示。可知，在相差图像中，未修饰处理对照组图案的背景基底上有明显的细胞黏附，而经过MPTES修饰处理图案组的基底上未见明显的细胞黏附。由于在相差图像中较难分辨纤维上是否有明显细胞黏附，进一步利用SEM对纤维图案微区进行观察。在对照组中，可以清楚地看到细胞在纤维材料及未处理基底表面均有明显的黏附，而在背景经过修饰处理后的单层平行纤维图案表面，细胞仅能在纤维上发生黏附和伸展，而在背景区域则无明显的细胞黏附。另外，由于黏结纤维端部与基底边缘部位所选的材料为具有良好生物相容性的PDMS，因而对体系中待考察的细胞无毒无害，细胞在能够黏附的区域均体现出了较好的黏附生长状态，这为后续考察细胞-纤维材料相互作用提供了极大便利。

图6 L929成纤维细胞在基底未修饰处理和修饰处理后的单层平行纤维图案上的黏附情况Fig.6 Adhesion of L929 cells on single-layer and parallel arranged fiber patterns with unmodified or modified substrate.(a)Inverted phase contrast microscope images; (b)SEM images

上述结果表明，本文制备的单层平行纤维图案具有优秀的细胞黏附反差特性，即细胞仅能黏附到纤维材料上，而不能黏附到基底表面。另外，由于纤维呈单层平行排布特征，也有效排除了传统材料平台中细胞在上下纤维间的跨越黏附干扰，较大的纤维间间距(大于100 μm)亦可排除细胞在左右纤维间的跨域黏附干扰。这种单层平行纤维图案能够有效排除各类背景黏附的干扰，在考察纤维特征对细胞行为的影响及细胞-纤维相互作用方面具有明显的优势和潜力。

3 结 论

本文制备了2种不同直径的具有细胞黏附反差特性的单层平行丝素蛋白纤维图案，通过分析得知纤维直径及纤维间间距可通过工艺调控，利用寡聚乙二醇硅烷化试剂接枝修饰后的玻片基底具有优秀的抗细胞黏附特性。所制备的单层平行纤维图案具有优秀的细胞黏附反差特性，在排除各类背景黏附干扰的基础上，可独立考察纤维自身特征对细胞行为的影响，为深入揭示细胞-纤维相互作用规律提供了有效的材料平台。

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