龟龄集胶囊对SAMP8小鼠不同组织MDA、SOD、GSH-PX及端粒酶的影响*

陈慧琴 李玺 权乾坤 李明

(1.西安交通大学第二附属医院，陕西 西安 710004；2.西安市人民医院，陕西 西安 725000)

龟龄集创见于1541年明朝嘉靖年间宫廷御方，其具有延年益寿、强身补脑、固肾补气、增进食欲之功效，临床主要用于肾亏阳弱、记忆减退、夜梦精溢、腰酸腿软、气虚咳嗽、五更溏泻、食欲不振等症[1]，在《中国长寿大辞典》中龟龄集列益寿强身内服药之首，是著名的抗衰老处方[2]。杨小玲等[3]研究表明龟龄集可延缓D-半乳糖致衰老模型大鼠的自主活动，改善大鼠的衰老行为。赵思俊等[4]研究证实龟龄集能明显改善衰老引起的学习记忆功能减退，同时在提高免疫、改善生殖、保护肝脏方面也具有一定作用。张志伟等[5]从实验研究及临床研究两方面总结了龟龄集的研究现状，其作用涉及延缓中枢神经衰老、增强记忆及识别能力、镇静安神、抗癫痫、护肝、增强心肌收缩力、增强非特异性免疫功能和特异性免疫功能等。

抗衰老是龟龄集主要功效之一，然而目前关于龟龄集抗衰老的作用机制还不完全明了。本研究通过观察龟龄集胶囊对SAMP8小鼠心、肝、肾、脑不同组织丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)水平及端粒酶活性的影响，以探讨研究龟龄集抗衰老的作用机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 DH36001B电热恒温培养箱(天津泰斯特公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(上海科析公司)；UV752紫外可见光分光光度计(湖南湘仪公司)；NANO 2000紫外分光光度计(美国Thermo公司)；Exicycler TM 96 Real Time 96荧光定量PCR仪(韩国BIONEER公司)。

1.2试药 龟龄集胶囊(批号20151108)，由山西广誉远国药有限公司提供；MDA检测试剂盒(货号WLA048)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004a)；SOD活性检测试剂盒(货号WLA110 )；BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号WLA004)、GSH-Px 活性检测试剂盒(货号WLA107)购自沈阳wanleibio公司; TRIpure(货号RP1001)、Super M-MLV 反转录酶(货号PR6502)、RNase inhibitor(货号RP5602)购自北京BioTeke公司；2×Taq PCR MasterMix(货号PC1150)、SYBR Green(货号SY1020)购自北京Solarbio公司；实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒(货号KGA1028M)购自江苏KeyGEN公司。

1.3实验动物 加速老化小鼠模型(SAMP8小鼠)是一个从普通的遗传群AKR/J系小鼠中通过表型选择培育出的加速老化小鼠，具有快速老化伴随学习记忆功能障碍的特点，是目前研究衰老性认知障碍较理想的动物模型。同属SAMR1表现为抗快速老化，具有正常的老化特性，常用作SAMP8小鼠的正常对照。本研究中SAMP8小鼠和SAMR1小鼠均购自北京华阜康生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2020-0004。其中SAMP8小鼠32只，SAMR1小鼠8只，均为8月龄，雌雄各半，体重(30±5)g，均饲养在12 h 明暗交替、室温23 ℃、相对湿度(50±10)%的环境中，允许自由地进食和饮水。

2 实验方法

2.1分组与给药干预 将32只SAMP8小鼠按性别依据随机数字表法随机分为模型组、龟龄集低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组8只，雌雄各半；8只SAMR1小鼠为对照组。适应性喂养后，龟龄集低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按0.125、0.25、0.5 g·(kg·d)-1剂量予以龟龄集胶囊灌胃，对照组和模型组小鼠灌服等体积的生理盐水，干预持续28 d。干预结束后上述动物经水合氯醛腹腔麻醉后取心、肝、肾、脑组织用于后续实验。

2.2MDA、SOD、GSH-Px含量检测 将各组心、肝、肾及脑组织匀浆后采用BCA法进行蛋白浓度测定，然后参照 MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒说明书检测MDA含量及SOD、GSH-Px活性，最后采用紫外可见光分光光度计检测各组样本吸光度OD值。检测结果计算：MDA含量(nmol·mgprot-1)=[(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准管浓度(10 nmol·mL-1)/待测匀浆蛋白浓度(mgprot·mL-1)；SOD活力(U·mgprot-1)=[(对照OD值-测定OD值)/ 对照OD值]/50%×[反应液总体积(mL)/取样量(mL)]/待测样本蛋白浓度(mgprot·mL-1)；GSH-Px酶活力(U·mgprot-1)=[(非酶管OD值-酶管OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准管浓度(20 μmol·L-1)×稀释倍数/反应时间/样本蛋白含量(mg·mL-1)。

2.3端粒酶活性检测 采用实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒检测各组小鼠心、肝、肾及脑组织端粒酶活性。首先采取TRIpure法提取心、肝、肾及脑样本组织总RNA，使用紫外分光光度计测定各样本中RNA的浓度。参照说明书在PCR仪进行逆转录反应：将提取的RNA及oligo(dT)15、random、ddH2O加入无核酸酶的离心管，70 ℃加热5 min，冰上冷却2 min，离心后加入dNTP、5×Buffer、Rnase inhibitor、Super M-MLV，25 ℃温浴10 min，42 ℃温浴50 min，最后80 ℃ 加热10 min终止反应，从而得到 cDNA样本。然后在Exicycler PCR仪进行荧光实时定量PCR反应。反应体系：Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×)10 μL、TERT-F/TERT-R Primer(10 μmol·L-1) 1 μL、GAPDH-F/GAPDH-R Primer(10 μmol·L-1)1 μL、Template DNA<500 ng，加入Water Nuclease-free至体系为20 μL。反应条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。采用 2-△△ CT法分析荧光实时定量结果。

3 实验结果

3.1对8月龄小鼠心、肝、肾、脑组织中MDA含量的影响 与对照组比较，模型组小鼠心、肝、肾、脑组织中MDA含量明显升高(均P<0.05)；与模型组比较，龟龄集低、中、高剂量组小鼠心、肝、肾、脑组织中MDA含量均有不同程度下降(均P<0.05)，其中以龟龄集大剂量组下降最明显(与龟龄集低、中剂量组比较，P<0.05)。结果见表1。

表1 对8月龄小鼠心、肝、肾、脑组织中MDA含量的影响

3.2对8月龄小鼠心、肝、肾、脑组织中SOD活性的影响 与对照组比较，模型组小鼠心、肝、肾、脑组织中SOD活性明显下降(均P<0.05)；与模型组比较，龟龄集低、中、高剂量组小鼠心、肝、肾、脑组织中SOD活性均有不同程度升高(均P<0.05)，其中以龟龄集大剂量组升高最明显(与龟龄集低、中剂量组比较，P<0.05),结果见表2。

表2 对8月龄小鼠心、肝、肾、脑组织中SOD活性的影响

3.3对小鼠心、肝、肾、脑组织中GSH-Px酶活力的影响 与对照组比较，模型组小鼠心、肝、肾、脑组织中GSH-Px活性明显下降(均P<0.05)；与模型组比较，龟龄集低、中、高剂量组小鼠心、肝、肾、脑组织中GSH-Px活性均有不同程度升高(均P<0.05)，其中以龟龄集大剂量组升高最明显(与龟龄集低、中剂量组比较，P<0.05),结果见表3。

表3 对8月龄小鼠心、肝、肾、脑组织中GSH-Px活性的影响

3.4对小鼠心、肝、肾、脑组织中端粒酶活力的影响 与对照组比较，模型组小鼠心、肝、肾、脑组织中端粒酶活性明显下降(均P<0.05)；与模型组比较，龟龄集低、中、高剂量组小鼠心、肝、肾、脑组织中端粒酶活性均有不同程度升高(均P<0.05)，其中以龟龄集大剂量组升高最明显(与龟龄集低、中剂量组比较，P<0.05),结果见表4。

表4 对8月龄小鼠心、肝、肾、脑组织中端粒酶活性的影响

4 讨论

衰老是指随着机体年龄增长逐渐出现生理功能、行动能力、反应能力等的衰退，组织结构及器官功能等逐渐退化的不可逆性现象[6]。目前研究认为自由基与衰老密切相关。随着年龄的增长，自由基产生增多，清除能力却下降，进而导致体内自由基过剩，从而促进机体的衰老；而体内氧自由基生成过多能诱发组织脂质过氧化，从而引起细胞的破坏，最终导致机体衰老[7]。SAMP8小鼠具有快速老化伴随学习记忆功能障碍的特点,表现为全面的脑病理变化，包括皮质萎缩、神经细胞丢失、神经胶质增生和血管损伤，是研究衰老性认知障碍较理想的动物模型。SAMR1小鼠表现为正常老化，通常作为SAMP8小鼠的正常对照[8]。故本研究选择SAMP8及SAMR1小鼠作为实验动物。

SOD是体内一种清除氧自由基的酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，是机体抗自由基损伤的重要防御机制，SOD通过催化超氧阴离子歧化为H2O2和O2，从而达到清除自由基、抗衰老的作用[7-9]。GSH-Px是机体另一种抗氧化的重要酶，其能催化还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)还原脂质氢过氧化物成羟基化合物，从而清除自由基，发挥抗氧化作用[10-11]。研究证实SOD和GSH-Px的活性均随着年龄增长而减弱，二者是评价衰老的重要指标[10-11]。本研究发现在快速老化小鼠的心、肝、肾及脑组织SOD活性及GSH-Px活性下降，再次证明SOD及GSH-Px与衰老有密切关系。本研究通过龟龄集干预后，快速老化小鼠不同组织SOD活性及GSH-Px活性均增加，与模型组比较，龟龄集低、中、高剂量组优于模型组(均P<0.05)，表明龟龄集可能通过上调SOD活性及GSH-Px活性，通过清除氧自由基，发挥其抗衰作用机制。

MDA 是体内脂褐素形成的中间产物，随着年龄的增长而升高，其能间接反映机体内的脂质过氧化水平，反映机体内自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度，在老年色素类生物垃圾以及与衰老相关的蓄积产物的形成过程中起着核心作用[9-12]。MDA既是评价衰老的重要指标之一，又可反映组织氧化的程度。本研究发现在快速老化小鼠心、肝、肾及脑组织MDA含量增加，通过龟龄集干预后可以降低MDA含量。

端粒是染色体末端一段由短的重复的非编码DNA序列组成的一段特殊DNA，其主要作用是保持染色体结构的完整性，从而维持基因组的稳定性[12]。端粒的主要功能包括：特殊结构保护染色体末端[13]，缓冲保护防止染色体复制时末端丢失[14]，端粒DNA与核基质蛋白固定染色体的位置[15]，端粒长度决定细胞的寿命[16]。端粒酶是一种具有端粒末端转移功能的核糖核酸蛋白复合物，它以自身的RNA为模板，在染色体末端加入多个重复的TTAGGG六聚体，能维持细胞分裂过程中丢失的染色体端粒区域[17]。研究证实端粒在人的正常体细胞中长度是有限的，随着细胞分裂次数的增多和年龄的增长，端粒会逐渐缩短，当端粒缩短到不足以维持细胞分裂时，便会终止细胞分裂，细胞便会自然衰老死亡。端粒酶有维持端粒长度的作用，当细胞中端粒酶活性重新激活时细胞便成为永生化细胞从而进入无限增殖分裂过程[18]。已证实绝大多数永生化细胞系中检测到较高的端粒酶活性[19]。端粒酶不但可以使细胞永生化，也能防止或逆转衰老细胞生理功能的丧失，而不会引起与癌相关的其他改变，此外，端粒酶在保持基因组完整、潜在的继续增殖能力和细胞长期活性等方面也具有重要作用。本研究结果显示龟龄集可以提高快速老化小鼠不同器官组织下降的端粒酶活性，证实了龟龄集对端粒酶的影响。但是关于龟龄集影响端粒酶活性的机制目前还不清楚，未来将开展相关研究进一步探讨该问题。

总之，本研究证实龟龄集胶囊能有效降低SAMP8小鼠心、肝、肾及脑组织MDA含量，提高SOD、GSH-PX及端粒酶活性，通过清除氧自由基，从而发挥抗衰老作用，这为临床应用其抗衰老治疗提供了理论依据。