刺梨鲜果质量标准提升研究

祝清灿 石亚 孙宜春 段丽 王杏 刘凯 李慧馨 丰敏

【摘 要】 目的：进一步提升鲜刺梨果药材质量标准。方法：用薄层色谱法（TLC）对鲜刺梨果药材进行鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）对刺梨果中的维生素C进行含量测定。结果：供试品薄层色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点;维生素C进样量在0.6606～3.9636 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（R2=0.9998）;平均回收率为：98.37%，RSD=2.0%;结论：薄层鉴别方法专属性强，高效液相色谱法精密度高，重复性好，可用于刺梨果的质量控制。

【关键词】 刺梨果;质量标准;薄层色谱;HPLC;维生素C

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2022）16-0048-05

Study on the Improvement of the Quality Standard of Rosa Roxburghii Tratt

ZHU Qingcan SHI Ya SUN Yichun* DUAN Li WANG Xing LIU Kai LI Huixin FENG Min

Sinopharm Group Tongjitang（Gui zhou） Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang 550026， China

Abstract：Objective  Further improve the quality standards of Rosa roxburghii Tratt.Methods Thin layer chromatography （TLC） was used to identify the Rosa roxburghii Tratt， and the content of vitamin C in the Rosa roxburghii Tratt was determined by high-performance liquid chromatography （HPLC）.Results In the thin layer chromatography of the test product， spots of the same color appeared on the corresponding position of the chromatogram of the control medicinal material; the injection amount of vitamin C showed a good linear relationship with the peak area in the range of 0.6606～3.9636 μg （R2=0.9998）; average recovery Rate 100.22%， RSD=1.57%.Conclusion The thin-layer identification method has strong specificity， high-performance liquid chromatography with high precision and good repeatability， and can be used for quality control of prickly pear fruit.

Key words：Rosa Roxburghii Tratt; Quality Standard; Thin Layer Chromatography; HPLC; Vitamin C

刺梨，又名送春花、茨梨、木梨子、梨石榴，為蔷薇科植物单瓣缫丝花Rosa roxburghii Tratt.f.normalis Rehd.et Wils.及缫丝花Rosa roxburghii Tratt.的果实，味酸甜、涩，8～10月采收，鲜用，为《贵州省中药材、民族药材质量标准》[1]收录的贵州省少数民族用药，广泛分于贵州、云南、四川、陕西、甘肃、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、西藏等省区，是贵州特色水果资源。具有消食健脾，收敛止泻的功效，临床主要用于积食腹胀、泄泻等。现代研究[2]表明，刺梨果肉中含大量的维生素、有机酸、超氧化物歧化酶（SOD）、刺梨黄酮、刺梨多糖、氨基酸、微量元素等成分，尤以维生素C的含量最为丰富，被誉为“维C之王”，具有抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老、抗应激、调节消化系统、降低重金属负荷等药理作用[3-6]。现行标准项下仅收载性状、理化鉴别项目，鉴别方法专属性不强。贵州省药品监督管理局将刺梨纳入《贵州省中药材、民族药材质量标准研究》计划，笔者建立了薄层色谱鉴别方法，采用高效液相色谱法测定鲜刺梨果中维生素C含量，为质量标准修订提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Vanquish型超高效液相色谱仪 （赛默飞世尔科技有限公司）;Agilent 1260型高效液相色谱仪[ 安捷伦科技（中国）有限公司];色谱柱：PntulipsTM BP-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate Hilic-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;菲罗门 ACE Excel NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;Goodsee-II型紫外分析仪（上海科哲生化科技有限公司）;202-0型电热鼓风干燥箱（上海路达实验仪器有限公司）;ME204TE/02型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司];SB25-12DTS型数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药 刺梨对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121356-200401）;维生素C对照品（中国食品药品检定研究院，批号：C100425-201504）;乙腈（美国天地，批号：19035082）;甲醇[重庆江川化工（集团）有限公司，批号：21070908];乙醇[重庆川东化工（集团）有限公司，批号：20170901];盐酸[重庆川东化工（集团）有限公司，批号：20200401];乙酸乙酯（成都市科龙化工试剂厂，批号：2017050201）;醋酸[重庆川东化工（集团）有限公司，批号：20190701];二水合草酸（成都金山化工试剂厂，批号：20170312）;磷酸[重庆川东化工（集团）有限公司，批号：20190601];化学试剂均为分析纯;水为自制纯化水。

1.3 材料 自制硅胶G薄层板（批号：20171108）;硅胶G薄层板（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司，批号：20140820）;硅胶G预制板（德国默克公司，批号：1.05626.0001;国药集团化学试剂有限公司，批号：20170912）;硅胶G薄层板（批号：20170720）、硅胶G高效板（批号：20170831）、硅胶H板（批号：20160715）、硅胶GF254板（批号：20140910）均购自青岛海洋化工有限公司。样品由国药集团同济堂（贵州）制药有限公司种植部提供，经贵州中医药大学药学院何顺志教授鉴定为蔷薇科植物单瓣缫丝花Rosa roxburghii Tratt.f.normalis Rehd.et Wils.及缫丝花Rosa roxburghii Tratt.的果实。凭证标本存放于国药集团同济堂（贵州）制药有限公司。样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别 将鲜刺梨果捣碎，取果肉浆约10 g，加水20 mL，超声处理20 min，过滤，取滤液，用盐酸饱和的乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取刺梨果对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法《中国药典》2020年版四部通则（0502）试验[7]，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，挥干，105 ℃加热至斑点显色清晰。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图1所示。

2.2 维生素C含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性试验 以氨基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇∶0.1%偏磷酸溶液（10∶90）为流动相;检测波长为243 nm;流速为1mL·min-1;柱温为30 ℃，进样量为10 μL。理论板数按维生素C峰计算不低于5000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取维生素C对照品适量，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加0.5%亚硫酸氢钠（用磷酸调节pH值至 2.4）溶解并稀释至刻度 ，制成1 mL含有100 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 将鲜刺梨果捣碎，取果肉浆约4 g，精密称定，置于250 mL的棕色容量瓶中，加入0.5%亚硫酸氢钠溶液（磷酸调节pH值至2.4）至刻度，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用0.5%亚硫酸氢钠溶液补足损失的重量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液[8]。

2.2.4 空白对照溶液制备 取0.5%亚硫酸氢钠溶液作为空白对照溶液。

2.2.5 专属性 分别取“2.2.2、2.2.3、2.2.4”项下对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果表明，分离度符合要求，阴性样品无干扰，如图2所示。

采用二级管阵列检测器对供试品溶液中的维生素C色谱峰进行峰光谱扫描和纯度检测，结果显示，峰纯度角度<峰纯度阈值，供试品中维生素C光谱图与谱库中维生素C光谱图匹配理想，说明维生素C峰为纯峰，专属性符合要求。

2.2.6 线性关系考察 精密称取维生素C对照品适量，置10 mL棕色容量瓶中，加0.5%的亚硫酸氢钠（用磷酸调节pH值至2.4）溶液溶解并稀释到刻度，即得（每1 mL含维生素C 3.303 mg），作为储备液。分别精密吸取该储备液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，置于10 mL的棕色容量瓶中，用0.5%的亚硫酸氢钠（磷酸调节pH为2.4）溶液定容，制成系列浓度对照品溶液I～Ⅵ（浓度分别为：0.06606 mg·mL-1、0.13212 mg·mL-1、0.19818 mg·mL-1、0.26424 mg·mL-1、0.33030 mg·mL-1、0.39636 mg·mL-1），分别精密吸取系列浓度对照品溶液I～Ⅵ各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”色谱条件测定各自峰面积。以对照品进样量（μg）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，求得维生素C的线性回归方程为：Y=32.656X+135.61，R2=0.9998，结果表明：维生素C进样量在0.6606～3.9636 μg的范围内与峰面积值呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 精密吸取维生素C对照品溶液（每1 mL含维生素C 0.9818 mg）10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，计算6次维生素C峰面积的RSD值。结果，维生素C峰面积的RSD值为1.0%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.2.8 重复性试验 将鲜刺梨果（批号：200901）捣碎，混匀，取6份，每份约4 g，精密称定，按正文供试品溶液制备方法及色谱条件测定，计算6份样品中维生素C峰面积的RSD值。结果，6次维生素C峰面积的RSD=2.3%，表明该方法的重复性良好。

2.2.9 稳定性试验 取“2.2.8 重复性试验”制备的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h测定维生素C的峰面积，计算维生素C峰面积的RSD值。结果表明，维生素C的RSD 为0.21%，表明维生素C在24 h内基本稳定。

2.2.10 耐用性考察 将鲜刺梨果（批号：200901）捣碎，混匀，取约4 g， 按“2.2.3”供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，采用3种品牌的色谱柱测定维生素C的含量，色谱柱：PntulipsTM BP-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate Hilic-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;菲罗门 ACE Excel NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），结果显示，色谱峰分离均良好，含量测定结果无显著差异，RSD=2.6%，表明测定方法的耐用性较好。

2.2.11 加样回收试验 取已知含量的鲜刺梨药材（批号：200901，含量为5.72 mg·g-1）捣碎，混匀，取9份，每份约0.2 g，精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，按已知含有量的80%、100%、120%水平加入对照品溶液（每1 mL含维生素C 0.9818 mg），1～3号样品每份分别精密加入对照品溶液0.8 mL;4～6号样品每份分别精密加入对照品溶液1.0 mL;7～9号样品每份分别精密加入对照品溶液1.2 mL;按“2.2.3”供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算维生素C回收率，维生素C平均回收率为98.37%，12次测回收率的RSD=2.0%，表明方法的准确度较好。结果见表2。

2.2.12 样品含量测定 取鲜刺梨药材12批，按“2.2.3”供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定维生素C含量，结果见表3。

根据测定结果，12批鲜刺梨药材含量范围为5.16～10.22 mg·g-1，平均值为7.22 mg·g-1，以平均值的80%设限时，为5.78 mg·g-1，考虑到各种药材原料含量的波动，故建议将鲜刺梨中维生素C含量限度标准暂定为不得少于5.50 mg·g-1。

3 討论

3.1 薄层色谱法供试品溶液制备 根据化学成分的溶解性，分别对提取溶剂（甲醇、乙醇、水），提取方法（超声、回流），提取溶剂用量（10 mL、20 mL、30 mL），萃取溶剂（乙醚、乙酸乙酯），萃取剂用量（10 mL、20 mL、30 mL）等条件进行考察，结果表明，以文章中制备方法制备的供试品溶液鉴别斑点最清晰。

3.2 薄层色谱条件考察 根据展开样品主要化学成分的极性，对展开系统如石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲醇（5∶6∶1），正己烷-乙酸乙酯-甲醇（5∶4∶1），硅胶板种类（硅胶G板、硅胶H板，硅胶GF254板），样品点样量（3 μL、5 μL、7 μL、10 μL），点样条带宽度（5 mm、6 mm、7 mm、8 mm），薄层板预平衡时间（10 min、20 min、30 min），展开温度（10 ℃、20 ℃、30 ℃）等进行了考察。结果表明，使用文章中所用的色谱条件时，展开效果较好，供试品与对照品及对照药材在不同的检视条件下色谱条带数较多，分离度较好。

3.3 高效液相色谱法供试品溶液制备 分别对提取溶剂[1.0%草酸溶液、0.001 moL·L-1盐酸溶液、0.5%亚硫酸氢钠溶液（用磷酸调节pH值至2.4）、0.5%醋酸溶液]，提取方法（超声、回流），提取溶剂用量（150 mL、200 mL、250 mL），提取时间（10 min、20 min、30 min）等条件进行考察，结果表明，以文章中制备方法制备的供试品溶液峰面积最大。

3.4 高效液相色谱法色谱条件选择 分别考察采用乙腈-0.01 moL·L-1磷酸氢二钾（10∶90），甲醇-0.01 moL·L-1磷酸氢二钾（10∶90），乙腈-0.1%偏磷酸（10∶90）及不同比例的甲醇-0.1%偏磷酸为流动相时的分离情况，结果表明：以甲醇-0.1%偏磷酸（10∶90）为流动相，各色谱峰的分离效果较好。采用二极管阵列检测器对供试品溶液中维生素C在200 nm～450 nm范围内进行全波长扫描，结果表明，维生素C在波长为243 nm处的峰纯度较高，峰面积最大，由此确定检测波长为243 nm。

综上，鲜刺梨的薄层色谱鉴别方法专属性强，阴性样品无干扰，薄层色谱斑点清晰，分离度较好;维生素C含量测定方法的专属性较强，准确度较高，稳定性、耐用性、重现性较好;可以为提高刺梨药材的质量控制标准提供科学依据。

参考文献

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[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部 [S].2020年版.北京：中国医药科技出版社，2020：702-1703.

（收稿日期：2021-12-22 编辑：黄丽君）

基金项目：贵州省中药材、民族药材质量标准研究课题（编号：DBXZYC52170）。

作者简介：祝清灿（1974-），男，白族，本科，副主任药师，研究方向为中成药工艺及质量标准研究。E-mail：657662046@qq.com

通信作者：孙宜春（1984-），男，汉族，博士，副主任药师，研究方向为中药成药质量标准研究。E-mail：657662046@qq.com