刺梨叶提取工艺优化及其抗氧化活性研究

刘丹 丁小艳

摘 要：目的：比较不同极性部位提取物抗氧化能力和成分类型，为刺梨叶所含成分进一步研究提供参考方向。方法：通过正交实验优化刺梨叶供试液提取工艺，将提取液分别依次用乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次萃取，得到醇层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层，以DPPH自由基清除率和总抗氧化力为评价指标，比较不同层提取物抗氧化能力。结果：提取条件最佳组合为料液比1∶30、超声时间60 min、乙醇浓度60%。正丁醇层提取物的抗氧化能力最强。结论：刺梨叶中富含多酚黄酮类物质，正丁醇层提取物具有更强的抗氧化能力。

关键词：总黄酮;总多酚;提取工艺;抗氧化活性

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Active Substance from Rosa Roxburghii Leaves

LIU Dan1， DING Xiaoyan2

（1.Guizhou Institute for Food and Drug Control， Guiyang 550004， China; 2.Guizhou Material Industry Technology Research Institute， Guiyang 550016， China）

Abstract： Objective： The antioxidant capacity and component types of extracts from different polar parts were compared to provide a reference direction for the further study of the components contained in Rosa roxburghii leaves. Method： The extraction process of the test solution from Rosa roxburghii leaves was optimized by orthogonal experiment. The extract was extracted with ethyl acetate and water saturated n-butanol in turn to obtain alcohol layer， ethyl acetate layer， n-butanol layer and water layer. The antioxidant capacity of the extracts from different layers was compared with DPPH free radical scavenging rate and total antioxidant capacity. Result： The best combination of extraction conditions was solid-liquid ratio 1∶30， ultrasonic time 60 min and ethanol concentration 60%. N-butanol extract has the strongest antioxidant ability. Conclusion： Rosa roxburghii leaves are rich in polyphenols and flavonoids， and n-butanol layer extract has stronger antioxidant capacity.

Keywords： total flavonoids; total polyphenols; extraction process; antioxidant activity

實验中所用刺梨叶，被2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收录，是药食同源植物，在贵州省等地分布较为广泛，目前在贵州多地有种植基地，为贵州的优势经济作物[1-3]。近年来，刺梨产业的发展得到了贵州省委、省政府的高度重视，大力支持相关的科学研究。

刺梨叶中的成分对自由基有清除作用。刺梨中的多酚类、黄酮类成分，已被研究证明具有很好的抗氧化作用[4-6]。在近年来的研究中发现刺梨叶有α-葡萄糖苷酶抑制活性，对2型糖尿病大鼠脂代谢也起一定的治疗作用[7-11]，这都与刺梨叶的抗氧化机制相关，说明刺梨叶中的抗氧化活性物质值得被深入研究，可制成茶叶等饮品，具有广阔的食品、保健食品应用前景。本实验优化刺梨叶活性成分提取工艺，再比较刺梨叶不同极性部位提取物的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺梨叶样品为蔷薇科蔷薇属植物缫丝花的干燥叶;Folin-Ciocalteu试剂（F-C试剂，自制）;没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110831-201204）;芦丁对照品（成都曼斯特生物有限公司，批号MUST-11040302）;水为去离子水;试剂均为分析纯。

CARY100-Bio紫外-可见分光光度计（美国瓦里安中国有限公司）;DY-H4-型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）;KQ-500DB超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;ACCULAB型万分之一电子天平（深圳市郎普电子科技有限公司）;高速中药粉碎机（上海精宏试验设备有限公司）;高效液相色谱仪（美国沃特世中国有限公司）;ALC-210.4电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）;GZX-GFC-101-2-BS型电热恒温鼓风干燥箱（上海博泰实验设备有限公司）;80-2台式低速离心机（上海医疗器械集团有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液制备

（1）提取工艺优化供试品溶液制备。刺梨叶干燥后粉碎，过筛，得刺梨叶供试品。称取适量刺梨叶供试品，加入10倍量的石油醚浸泡达24 h脱色后，过滤，用石油醚洗涤，干燥后称取1 g样品于50 mL锥形瓶中，精密称定，设置60%乙醇超声提取，

3 000 r/min离心10 min，取上清液稀释后待测。

（2）对照品溶液制备。①芦丁标准溶液的配制。准确称取芦丁对照品116.84 mg置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释并定容至刻度，制得2.29 mg/mL对照品储备液。精密吸取2.5 mL对照品储备液于25 mL

容量瓶中，60%乙醇稀释至刻度，制得229.0 μg/mL芦丁标准液[12]。②没食子酸标准溶液配制。精密称取没食子酸对照品50.0 mg于50 mL容量瓶中，去离子水溶解定容至50 mL，得质量浓度为0.899 mg/mL没食子酸储备液。精密吸取该储备液5 mL于50 mL容量瓶中并用去离子水定容至刻度，制得89.9 μg/mL的没食子酸标准溶液[13]。

（3）抗氧化活性比较供试液制备。精密称取1.2.1项下脱色并干燥后的刺梨粉20 g，60%乙醇溶液，料液比1∶10（g∶mL），超聲提取60 min，提取2次，过滤。精密吸取滤液50 mL，为醇层，其他滤液减压蒸发回收乙醇，剩余水溶液分别采用极性增大的乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次萃取，最后为水相部位。

1.2.2 正交实验

根据前期的单因素实验，各条件最佳点为液料比25∶1，超声时间30 min，乙醇浓度60%。以各最佳点为中心设计正交实验。以目标函数确定达到总黄酮和总多酚的最佳提取条件，选择加权综合评分法，以总黄酮和总多酚各占50%来确定最佳提取工艺[14]，因素水平见表1。

1.2.3 总抗氧化力和DPPH自由基清除率测定

（1）总抗氧化力测定。精密称取不同极性部位提取物于25 mL容量瓶中，制成浓度为2.6 mg/mL的样品液，将样品液稀释10倍，则制得待测液。分别加入待测液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL和4.5 mL于10 mL具塞试管中（空白不加样液，以同体积超纯水代替），加超纯水至体积为1.5 mL，加入0.6 mol/L的H2SO4溶液1 mL，28 mmol/L的Na3PO4溶液1.5 mL，4 mmol/L的钼酸铵溶液1.5 mL，再加超纯水至总体积为10 mL，摇匀后置于95 ℃恒温水浴中1.5 h，取出，冷至室温，在695 nm波长处测定吸光度。每个样品平行3次实验。

（2）DPPH自由基清除率测定。将上述总抗氧化力测定中制成的样品液稀释100倍则制得待测液，分别取0.7 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.6 mL、1.9 mL和2.2 mL待测液，加超纯水至4 mL，再加0.25 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL，置暗箱中反应30 min，于517 nm处测定吸光度。对照不加供试液。每个样品平行3次实验。

2 结果与分析

2.1 正交实验优化

由表2可知，极差分析结果显示，提取条件中对测定结果影响程度由大到小的顺序为乙醇浓度、料液比、超声时间;由k值得，最优组合为A1B3C2，得分为664.20分，低于正交实验表中的最佳组合A3B3C2（684.89分）。因此当料液比1∶30、超声时间60 min，乙醇浓度60%时，综合评分最高，提取工艺最佳。

2.2 刺梨叶不同极性部位抗氧化力比较

由表3可知，刺梨叶不同部位的抗氧化能力大小均为水饱和正丁醇层>乙酸乙酯层>醇层>水层。

3 结论

刺梨叶的药理活性与其抗氧化机制有关，可开发相关的保健食品。实验前期研究中发现刺梨叶有很高的抗氧化活性，对刺梨叶的各个极性部位提取物的抗氧化活性进行对比，发现刺梨叶中起抗氧化作用的物质主要在正丁醇层，其次乙酸乙酯层，研究结果表明有必要对抗氧化能力强的极性部位进行深入研究。

参考文献

[1]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003.

[2]包俊.贵州苗族医药研究与开发[M].贵州：贵州科技出版社，1999.

[3]统战政协.把刺梨产业开发成为贵州精准脱贫特色产业[N].贵州政协报，2016-05-06（A2）.

[4]陈代雄，姜东，张永华，等.刺梨多糖对动物免疫功能的影响[J].遵义医学院学报，1991（1）：1-5.

[5]管春平，何艳娇，徐成东.滇大蓟中黄酮的提取及其对羟基自由基清除作用研究[J].楚雄师范学院学报，2013，28（6）：50-55.

[6]何伟平，腾建文，朱晓韵，等.刺梨Vc和多酚成分稳定性及抗氧化性研究[J].广西轻工业，2011，27（9）：1-3.

[7]黄康，王征.绿原酸防治2型糖尿病作用机制的研究进展[J].中国食物与营养，2013，19（9）：66-69.

[8]黄伟，安华明，杨玉，等.机械伤胁迫下刺梨果实的抗氧化反应[J].西南大学学报（自然科学版），2009，31（8）：109-113.

[9]简崇东，唐雄林，黄晓华，等.脑梗死患者口服刺梨汁抗动脉粥样硬化临床研究[J].亚太传统医药，2017，13（3）：136-137.

[10]简崇东.刺梨药理作用的研究进展[J].中国医药指南，2011，9（29）：38-40.

[11]李福明，汪洋，韦敏.刺梨叶醇提物体外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].中国现代应用药学，2015，32（6）：685-688.

[12]丁小艳.贵州不同基地刺梨果及叶质量对比分析及抗氧化活性研究[D].贵阳：贵州师范大学，2015.

[13]刘丹，江帆，丁小艳，等.黔产刺梨果中总多酚的含量测定及其干燥方式考察[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（23）：20-23.

[14]刘庆林，樊卫国，安华明.刺梨叶片中总黄酮和水溶性多糖的提取工艺[J].山地农业生物学报，2005（6）：

522-526.