响应面优化水解黑豆7S球蛋白制备抗氧化肽的研究

张茂迎，赵淼，刘畅，厉煜伟，李跃辉，杨凤旭，邹险峰

(长春大学 食品科学与工程学院，长春 130022)

黑豆(black bean)是一种豆科大豆属植物大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)的黑色种子。黑豆的营养价值非常高，黑豆中含有高达36%～40%的蛋白质，大约是肉类含量的2倍、鸡蛋的3倍、牛奶的12倍；黑豆的赖氨酸高于其他颜色的大豆，因此有“植物蛋白之王”的美誉[1]。

黑豆蛋白中的有些序列处于蛋白质分子结构内部，没有展现活性，经过酶解后，将这些序列释放出来，才表现出生理活性。黑豆多肽一般是用酶水解法或发酵法来制备的一种混合肽，通常由2～20个氨基酸残基组成，相对分子质量<10000 Da，而且不同的肽具有不同的氨基酸序列[2]。黑豆多肽含有人体所需的8种必需氨基酸，且含量较高[3]。

有研究表明，黑豆多肽具有抗氧化性，能够清除体内的自由基[4]，而且除抗氧化性外，黑豆多肽还有降血脂、降血压[5]、降低胆固醇[6]、抗疲劳[7]等功效。目前一般用酶解法、化学法以及辅助提取法等方式来制备黑豆多肽[8-9]。许庆鹏等通过碱性蛋白酶水解豌豆蛋白制备水解肽，水解肽的分子质量越小，抗氧化能力越强[10]。高嘉唯等通过对英国红芸豆蛋白进行酶解，酶解肽的总抗氧化能力高达186.97 U/mg[11]。张浩玉等采用碱性蛋白酶水解法酶解绿豆蛋白，制备出的绿豆蛋白水解肽具有羟自由基消除能力，在25 mg/mL时清除率达到最大值61.3%[12]。同时，通过生物酶法制备的水解肽有一些是呈味肽和生物活性肽[13]。范海茹等以高温豆粕为原料，通过探究不同的酶组合连续水解制备鲜味肽[14]。

本试验以黑豆7S球蛋白为原料，采用碱性蛋白酶水解黑豆7S球蛋白制备抗氧化肽，以羟自由基清除率为指标。在单因素试验的基础上，通过响应面法优化黑豆7S球蛋白酶解制备抗氧化肽清除羟自由基的工艺条件，为研究7S球蛋白水解肽的抗氧化活性、分离纯化及生产提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

黑豆：市售；碱性蛋白酶(酶活力200000 U/g)：北京鸿润宝顺科技有限公司。氢氧化钠、亚硫酸氢钠、氯化钠等试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

高速冷冻离心机 美国Sigma公司；UV-1900型紫外分光光度计 日本岛津公司；XIANOU-12型冷冻干燥机 吉林省华业科教仪器设备有限公司；PHS-3C型酸度计 上海雷磁仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；GDE酶消解池 意大利VELP公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑豆7S球蛋白的提取工艺

黑豆7S球蛋白的提取工艺参照Nagano等的方法[15-16]并稍加修改：黑豆→粉碎→过筛→石油醚脱脂过夜重复3次→脱脂黑豆粉→加水混合→调节pH至7.5(1 mol/L NaOH)→提取2 h→离心(9000 r/min，15 min)→上清液→添加亚硫酸钠(0.98 g/L)→调节pH至6.4→4 ℃过夜→离心(9000 r/min，15 min)→上清液→添加NaCl(0.25 mol/L)→调节pH至5.0(1 mol/L HCl)→提取1 h→离心(8500 r/min，30 min)→上清液冰水稀释2倍→调节pH至4.8(1 mol/L HCl)→离心(8500 r/min，15 min)→沉淀→冻干→黑豆7S球蛋白。

1.3.2 黑豆7S球蛋白的酶解工艺

黑豆7S球蛋白→加超纯水搅拌溶解→95 ℃水浴加热→冷却至25 ℃→调节pH值→加酶水解一定时间→95 ℃加热10 min灭酶→离心(5000 r/min，15 min)取上清液→测定羟自由基清除率。

1.3.3 单因素试验

本试验以黑豆7S球蛋白为原料，研究碱性蛋白酶水解制备抗氧化肽的工艺，以羟自由基清除率作为指标。以黑豆7S球蛋白质量作为基准，以酶解温度、pH、酶解时间以及酶添加量单因素进行试验。

1.3.3.1 酶解温度对羟自由基清除率的影响

酶解时间90 min、pH 9.0、酶添加量8000 U/g作为固定条件，测定当酶解温度为40，45，50，55，60 ℃条件下制备的水解肽对羟自由基清除率的影响。

1.3.3.2 pH对羟自由基清除率的影响

酶添加量8000 U/g、酶解温度50 ℃、酶解时间90 min作为固定条件，测定当pH为8.0，8.5，9.0，9.5，10.0条件下制备的水解肽对羟自由基清除率的影响。

1.3.3.3 酶解时间对羟自由基清除率的影响

酶解温度50 ℃、pH 9.0、酶添加量8000 U/g作为固定条件，测定当酶解时间为30，60，90，120，150 min条件下制备的水解肽对羟自由基清除率的影响。

1.3.3.4 酶添加量对羟自由基清除率的影响

pH 9.0、酶解时间90 min、酶解温度50 ℃作为固定条件，测定当酶添加量为4000，6000，8000，10000，12000 U/g条件下制备的水解肽对羟自由基清除率的影响。

1.3.4 羟自由基清除率的测定

羟自由基的测定参照罗丹明B-Fenton体系光度法[17]。

1.3.4.1 空白体系光密度值的测定

在2 mL Tris-HCl缓冲液中加入6.6 mL H2O和1.4 mL罗丹明B混匀，放置5 min后采用紫外分光光度计测定550 nm波长处的吸光度，记录为A。

1.3.4.2 羟自由基的测定

在2 mL Tris-HCl缓冲液中加入4.6 mL H2O、1.4 mL罗丹明B、1 mL Fe2+和1 mL H2O2混匀，放置5 min后采用紫外分光光度计测定550 nm波长处的吸光度，记录为A1。

1.3.4.3 样品对羟自由基的清除作用

在2 mL Tris-HCl缓冲液中加入3.6 mL H2O、1.4 mL罗丹明B、1 mL不同浓度的肽溶液、1 mL Fe2+和1 mL H2O2混匀，放置5 min后采用紫外分光光度计测定550 nm波长处的吸光度，记录为A2。

式中：Y为羟自由基清除率，%；A为空白吸光度；A1为羟自由基吸光度；A2为样品清除自由基吸光度。

1.3.5 响应面分析试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken的原理，选取酶解温度(X1)、pH(X2)、酶解时间(X3)和酶添加量(X4)4个因素作为自变量，以羟自由基清除率(Y)为响应值，进行4因素3水平响应面试验，因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.4 数据处理

试验重复3次，并用 Origin 2019 软件作图。使用Design Expert 8.0.6设计响应面试验，并对试验数据进行方差分析及二次多项式回归拟合。

2 结果与分析

2.1 黑豆7S球蛋白酶解单因素试验

2.1.1 酶解温度对羟自由基清除率的影响

图1 酶解温度对羟自由基清除率的影响Fig.1 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由图1可知，在酶解温度40～50 ℃区间内，羟自由基清除率的变化随着温度的提高而逐渐增大，在50 ℃以后，羟自由基清除率开始降低。在温度50 ℃时，羟自由基清除率最高，推测出碱性蛋白酶在50 ℃时发挥出较强的酶活性，水解产生更多的肽段，使羟自由基清除率增强。继续升高温度，酶可能部分失活，使酶不能充分水解7S球蛋白，因此羟自由基清除率比较低。因为酶只有在合适的温度下才能发挥出最佳活性，高于最适温度或者过低的酶解温度都会影响酶的活性，所以最适酶解温度为50 ℃。

2.1.2 pH对羟自由基清除率的影响

图2 pH对羟自由基清除率的影响Fig.2 The effect of pH on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由图2可知，随着pH值的不断增大，羟自由基的清除率也在不断增大，在pH 9.0时达到最大，当pH大于9继续提高时，羟自由基的清除率会不断降低，这是因为碱性蛋白酶只在pH 9.0下表现出较高的活性，当碱性蛋白酶在pH过高时结构会被破坏，或者不是适宜的pH条件下碱性蛋白酶不能发挥出应有的酶活性，导致黑豆7S球蛋白无法完全水解，因此羟自由基清除率不断下降[18]，所以最适酶解pH为9.0。

2.1.3 酶解时间对羟自由基清除率的影响

图3 酶解时间对羟自由基清除率的影响Fig.3 The effect of enzymatic hydrolysis time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由图3可知，随着酶解的进行，时间在30～90 min的过程中，羟自由基清除率逐渐增大，在90 min时达到最大值，继续增加碱性蛋白酶的酶解时间，羟自由基清除率开始出现下降趋势。可能是随着反应的进行，酶解时间延长，一方面，酶活性逐渐丧失；另一方面，少量肽被酶解成氨基酸，使得抗氧化肽活性下降，所以，最适酶解时间为90 min。

2.1.4 酶添加量对羟自由基清除率的影响

图4 酶添加量对羟自由基清除率的影响Fig.4 The effect of additive amount of enzyme on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由图4可知，随着碱性蛋白酶添加量的不断增加，羟自由基的清除率同样呈现出先增大后减小的趋势。在4000 U/g时羟自由基清除率最低，这可能是因为酶与底物反应不完全，产生较少的抗氧化肽，进而影响了羟自由基的清除率。在8000 U/g时羟自由基清除率达到最大，这可能是酶与底物结合较完全，水解产生较多的抗氧化肽。随着酶添加量的不断增加，清除率降低，一方面，酶与底物结合，酶过量会抑制酶解反应的进行；另一方面，可能是酶过量使抗氧化肽水解成小分子肽段，抗氧化活性降低[19]，所以最佳酶添加量为8000 U/g。

2.2 响应面法优化试验设计及结果分析

进一步采用响应面法对酶解黑豆7S球蛋白酶解工艺进行优化。以酶解温度(X1)、pH(X2)、酶解时间(X3)、酶添加量(X4)作为自变量，羟自由基清除率作为响应值的响应面试验结果见表 2。

表2 响应面试验设计与试验结果Table 2 Design and results of response surface test

对表2中试验数据进行二次多项回归拟合，获得响应面回归方程：Y=55.37-2.00X1+1.14X2-0.17X3+1.32X4-0.26X1X2+1.58X1X3-1.27X1X4+2.34X2X3-0.51X2X4-0.19X3X4-4.88X12-3.49X22-3.70X32-2.81X42。

羟自由基清除率的回归方程模型的方差分析见表3。

表3 回归方程模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation model

由表3可知，对所建立的回归模型进行分析，模型的P<0.0001，表明该回归模型极显著；模型的失拟项不显著，P为0.748，大于0.05。模型的决定系数(R2)为0.9603，调整决定系数(RAdj2)为0.9207，说明此模型的实际测量结果与预测的结果拟合较好，误差小。该模型中一次项X2、X4和交互项X1X3、X2X3均差异较显著，一次项X1和二次项X12、X22、X32、X42均差异极显著。由F值可看出，4个因素对羟自由基清除率的影响顺序依次为X1(酶解温度)>X4(酶添加量)>X2(pH)>X3(酶解时间)。

图5 酶解温度和酶解时间的交互作用对羟自由基清除率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface diagram and contour plot of the interaction of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

图6 pH和酶解时间的交互作用对羟自由基清除率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface diagram and contour plot of the interaction of pH and enzymatic hydrolysis time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

交互效应的强弱可以由等高线的形状反映出来，由图5和图6可知，交互作用等高线颜色变化明显，而且呈椭圆形，说明酶解温度和酶解时间以及pH和酶解时间的交互作用对羟自由基清除率的影响明显。3D图中，交互作用曲线较陡峭，随着水平的增加，羟自由基清除率先增大后减小。

2.3 模型验证试验

采用Design Expert 8.0.6软件分析，得到羟自由基清除率最大的酶解条件：酶解温度48.74 ℃、pH 9.07、酶解时间 88.79 min、酶添加量8559.67 U/g，预测羟自由基清除率为55.893%。为进一步验证响应面的结果是否可靠，在实际操作过程中，将最佳条件调整为：酶解温度49 ℃、pH 9.07、酶解时间88.79 min、酶添加量8560 U/g，进行3次验证试验。最终试验结果得到的羟自由基清除率的平均值是56.03%±0.18，与分析值相差0.25%，与响应面预测的结果比较吻合，说明响应面得出的最优参数具有可行性。

3 结论

试验利用单因素结合响应面分析方法优化了碱性蛋白酶水解黑豆7S球蛋白对羟自由基清除率的影响，并根据实际操作得到最优酶解参数：酶解温度为49 ℃，pH为9.07，酶解时间为88.79 min，酶添加量为8560 U/g，在此条件下得到的羟自由基清除率为56.03%±0.18。为黑豆7S球蛋白水解肽进一步应用在食品加工以及调味品领域提供了依据。