苎麻干粉绿原酸提取液体外替代抗生素研究

廖暑杰，王 丹，张昆朋，唐艳仪，揭雨成,2

（1.湖南农业大学苎麻研究所，湖南 长沙 410128；2.湖南省草类作物种质创新与利用工程技术研究中心， 湖南 长沙 410128）

抗生素的合成是医药领域最伟大的成就之一，但长期反复使用抗生素导致细菌耐药现象出现。据统计，我国每年有8 万人死于滥用抗生素。倍受人们关注的是，长期采食添加抗生素饲料的动物，其体内的微生物产生抗药性后通过食物链进入人体，导致人体也产生抗药性的问题。而中草药作为一种绿色安全的天然添加剂，可直接或间接作用于细菌等有害微生物，且不产生耐药性[1]。绿原酸（Chlorogenic acid），分子式为C16H18O9，分子量354.31[2]。目前人们对绿原酸的研究已深入到食品、保健、医药和日用等多个领域。它是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用[3]。

近年来，人们发现从绿色植物中提取的绿原酸能够抑制和杀灭多种致病细菌。洪亮等[4]在金银花、山银花提取物绿原酸进行体内外抑菌试验中发现其具有显著的抑菌作用。周志娥等[5]在研究绿原酸、异绿原酸A 对大肠杆菌抑菌机制中发现二者均可破坏细菌细胞壁、膜的结构，使细胞通透性增加，内容物外泄。王明英等[6]发现杜仲叶提取物对大肠杆菌，沙门氏菌等肠道菌具有一定的抑制作用。

肖传明等[7]在肉鸡日粮中添加植物提取物替代抗生素进行试验，结果表明，与抗生素组相比，试验组能显著提高肉鸡酶活力和消化率。唐保国等[8]在肉鸡基础日粮中分别添加由姜黄、柴胡、鱼腥草、灵香草等组成的中草药复方提取物（100 mg/kg）和吉他霉素（10 mg/kg）、金霉素+洛克沙砷（75+35 mg/kg）、黄霉素（5 mg/kg），进行饲养试验，结果表明，在肉鸡日粮中添加中草药可达到与抗生素相当的效果。刘则学等[9]发现，在仔猪日粮中添加5%的植物提取物绿原酸同样具有良好的抗腹泻和改善生产性能的作用，与抗生素效果相当。李成洪等[10]提取杜仲、女贞子、黄芪等植物中多糖、齐墩果酸成分0.5%添加于生长猪日粮中，发现植物提取物和金霉素均有提高生长猪日增重、改善饲料利用效率和降低猪腹泻的作用，且植物提取物促生长效果和预防猪腹泻效果优于金霉素。陶新等[11]通过添加不同复合植物提取物饲喂断奶仔猪，发现0.10%的复合植物提取物可替代饲用抗生素（金霉素+黄霉素），提高仔猪的生长性能，且具有抗应激和抗氧化功能。

苎麻是荨麻科苎麻属的多年生宿根型草本植物[12]，其绿原酸含量虽然比金银花、杜仲、蒲公英偏低，但是，Blasco 等[13]发现，在热带地区饲料用的苎麻每年可以收获14 次，鲜茎叶产量可达300 t/hm2，且我国是世界上最大的苎麻生产国，种植面积和产量占世界90%以上[14]。Maknev 等[15]研究发现饲喂苎麻粉的小牛比饲喂苜蓿粉的小牛长得更快，出肉率更高，Cleasby 等[16]通过用苎麻叶喂养山羊和绵羊，发现苎麻叶是一种很好的补充饲料，Squibb[17]发现5%的苎麻干粉能够预防幼鸡疾病的产生，8%的苎麻干粉可使鸡血液中的类胡萝卜素和维生素A 的含量显著增加；Squibb[18]通过养猪试验研究植物饲料蛋白质利用情况中发现，相比于黄豆，紫花苜蓿，香蕉叶，苎麻的效果最好；很多研究和生产实践表明，中草药替代抗生素效果明显，但苎麻的草粉替代抗生素效果研究很少见报道。为此，开展5 个高绿原酸饲用苎麻品种叶片、萝卜根、繁殖根干粉提取液体外抗菌试验，筛选出杀菌效果最好的苎麻品种及器官，将该品种的苎麻草粉添加到动物饲料中，可以促进我国无抗饲料的生产和应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试品种与测定材料参试苎麻品种为乐业灰绿苎、桐木苎麻、湘饲兼纤用苎麻1 号、红尖麻、芦竹青。将收获后的苎麻分器官置于烘箱中，105 ℃杀青，65 ℃烘干至恒重，用小型植物粉碎机粉碎，过80 目筛备用。测定材料为叶片、萝卜根、繁殖根干粉。

1.1.2 苎麻干粉绿原酸提取液称取1 g 苎麻干粉，加入50 mL pH 值为4 的50%乙醇浸泡24 h，40 ℃下超声波辅助萃取30 min，过滤，洗涤。重复提取2 次，并合并滤液，110 ℃常压蒸馏至25 mL（乙醇完全挥发）。

1.1.3 细菌种类与抗生素细菌种类为大肠杆菌、沙门氏菌。抗生素为盐酸金霉素。

1.1.4 试验仪器超声波清洗机，蒸馏装置，TU-1810 紫外可见分光光度机，高压蒸汽灭菌锅，TGL16离心机，超净工作台，恒温培养箱。

1.2 试验方法

1.2.1 不同苎麻品种各器官绿原酸含量的测定采用紫外-可见分光光度法测定：制作绿原酸标准曲线和测定绿原酸含量。以比较5 个苎麻品种不同器官绿原酸的含量。

1.2.2 不同品种各器官干粉绿原酸提取液体外抑菌试验采用紫外-可见分光光度法和比浊法进行测定，原理是：细菌菌液的吸光度与其浓度成良好的线性关系，并且相应的菌落计数结果稳定[19]。（1）普通营养肉汤培养基制备：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，加蒸馏水至1 000 mL，调节pH 值至7.2，121 ℃，高压灭菌20 min；（2）普通肉汤琼脂培养基制备：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L，加蒸馏水至1 000 mL，调节pH 值为7.2，121 ℃，高压灭菌20 min。（3）大肠杆菌与沙门氏菌菌悬液制备：将1 000 mL 的肉汤培养基分装到10 个高压灭菌处理过的锥形瓶内，5 个接种大肠杆菌，5个接种沙门氏菌，接种后放置于37 ℃、170 r/min 的摇床培养48 h，600 nm 处测定吸光度值在1.1～1.2，放入4 ℃冰箱内备用。

（4）不同品种各器官干粉绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果：在无菌工作台上取1 mL 细菌菌悬液于5 mL 苎麻提取液，3 组重复，5 mL 50%的乙醇，5 mL 无菌水中，以无菌水作为对照组，放置于37 ℃、170 r/min 的摇床培养48 h，以50%的乙醇菌液为空白，在600 nm 处测定吸光度。

1.2.3 不同品种叶片干粉提取液和金霉素体外抑菌试验KB-滤纸片法抑菌原理：将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。（1）不同品种叶片干粉绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果：称取10 g 过筛后的苎麻叶粉于烧杯中，加入pH 值为4 的50%的乙醇（固液比1 ∶50）浸泡24 h 后，40℃下超声波辅助萃取30 min，过滤，洗涤，重复提取2 次，并合并滤液，常压蒸馏至10 mL（相当于生药1 g/mL），将琼脂培养基融化，取10 mL 于平板上，待凝固后加入0.1 mL 细菌菌悬液，三角耙均匀涂抹，用无菌镊子将6 mm 无菌滤纸片浸泡于提取液中，贴在有菌的平板上，37 ℃恒温培养箱培养24 h，游标卡尺测量抑菌圈大小，每种提取液3 组重复；（2）金霉素对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果：配制1 g/mL 的金霉素溶液，取13 支无菌小试管，除第1 支外，每支试管加入3 mL 无菌水，取3 mL 1 g/mL的药液于第2 支试管中，混匀后取3 mL 于第3 支试管中，以此类推，到第13 支时，弃去3 mL，滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈大小，每个浓度的药敏片3 组重复，抑菌圈直径取平均值。试验分别以0.98、0.49 mg/mL 的金霉素作为抗生素对照组；（3）药物对细菌抑制作用标准：无抑菌圈为无敏，抑菌圈直径10 mm，低度敏感；10 mm ≤抑菌圈直径≤15 mm,中度敏感；抑菌圈直径15 mm，高度敏感[20]。

1.3 数据处理

试验所得数据用Excel 2010 进行统计，用SPSS 22.0 软件的一般线性模型和比较平均值的LSD 法和SNK 法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种各器官绿原酸含量的分析

由图1 可知，该5 个品种苎麻不同器官绿原酸含量具有差异性，叶片中的绿原酸含量最高，其次是繁殖根，萝卜根最低。叶片绿原酸含量最高的品种是乐业灰绿苎，含量达0.82%，其次是红尖麻、桐木苎麻，含量在0.46%～0.67%，湘饲纤兼用苎麻1 号和芦竹青含量最低，仅0.15%～0.19%；萝卜根中绿原酸含量差异不大，含量在0.10%～0.16%，繁殖根绿原酸含量最高的品种为乐业灰绿苎，达0.30%，芦竹青、红尖麻和桐木苎麻次之，含量在0.22%～0.27%，湘饲纤兼用苎麻1 号繁殖根绿原酸含量最低，为0.13%。

图1 苎麻各器官绿原酸含量比较

2.2 不同品种各器官干粉绿原酸提取液的杀菌效果

由表1 可知，添加了苎麻各器官干粉绿原酸提取液的培养液OD600值均比对照组降低，从而苎麻干粉绿原酸提取液具有一定的杀菌效果。其中，添加叶片提取液对大肠杆菌和沙门氏菌浓度影响比萝卜根和繁殖根的大。

2.2.1 苎麻各器官干粉绿原酸提取液对大肠杆菌OD600值的影响表1 结果表明，无菌水对照的的大肠杆菌OD600值最高，为0.394。叶片中，乐业灰绿苎、红尖麻和桐木苎麻的大肠杆菌OD600值（0.121～0.169）与无菌水对照的差异最明显（P＜0.05），比无菌水对照下降了57.11%～69.29%，芦竹青和苎麻1 号（0.234～0.245）也有明显降低（P＜0.05）；萝卜根中，乐业灰绿苎的大肠杆菌OD600值（0.190）与无菌水对照的差异最明显（P＜0.05），比无菌水对照下降了51.78%，其他品种（0.215～0.298）无菌水对照的差异也显著（P＜0.05）；繁殖根中，乐业灰绿苎、红尖麻的大肠杆菌OD600值（0.243～0.259）与无菌水对照的差异明显（P＜0.05），比无菌水对照下降了33.50%～38.32%，其他品种与无菌水对照无明显差异。在同一品种中，抑菌效果的大小顺序为叶片＞萝卜根＞繁殖根（P＜0.05），而各品种的平均抑菌效果差异较小（0.200～0.294）。

表1 苎麻各器官绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌浓度的影响

2.2.2 苎麻各器官干粉绿原酸提取液对沙门氏菌OD600值的影响表1 结果表明，叶片和繁殖根中，5 个品种的沙门氏菌OD600值均显著低于无菌水对照（P＜0.05），其中，叶片中的乐业灰绿苎、红尖麻和桐木苎麻与无菌水对照差异最明显，沙门氏菌OD600值下降了62%左右。在同一品种中抑菌效果：叶片＞繁殖根＞萝卜根（P＜0.05），各品种平均抑菌效果的大小顺序为桐木苎麻（0.267）＞乐业灰绿苎（0.280）＞红尖麻（0.288）＞芦竹青（0.317）＞苎麻1 号（0.392）。

2.3 不同品种叶片干粉绿原酸提取液与抗生素的抑菌效果比较

测量不同浓度抗生素对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径，发现抗生素浓度在31.25～500 mg/mL 对大肠杆菌的抑制效果为高度敏感，在3.91～15.63 mg/mL对大肠杆菌的抑制效果为中度敏感，低于3.91 mg/mL为低度敏感，低于0.98 mg/mL 为无敏；抗生素浓度在7.81～500 mg/mL 对沙门氏菌的抑制效果为高度敏感，在3.91～7.81 mg/mL 区间的抑制效果为中度敏感，低于3.91 mg/mL 的抑制效果为低度敏感，低于0.49 mg/mL 为无敏。

由表2 可知，将1 g/mL 乐业灰绿苎、红尖麻、桐木苎麻的叶片提取液与0.98 mg/mL 的抗生素对大肠杆菌的杀菌效果进行比较发现，桐木苎麻和乐业灰绿苎的叶片提取液与0.98 mg/mL 抗生素对大肠杆菌的抑制效果差异不明显，红尖麻的叶片提取液与该浓度抗生素差异明显（P＜0.05）。

表2 苎麻叶片干粉绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果

将1 g/mL 乐业灰绿苎、红尖麻、桐木苎麻的叶片提取液与0.49 mg/mL 的抗生素对沙门氏菌的抑菌效果进行比较发现，桐木苎麻的叶片提取液与0.49 mg/mL 抗生素对沙门氏菌的抑菌效果无明显差异，而乐业灰绿苎和红尖麻与该浓度抗生素差异明显（P＜0.05）。

3 结论与讨论

5 个苎麻品种不同器官绿原酸含量，以叶片最高，其次是繁殖根，萝卜根最低。叶片绿原酸含量最高的品种是乐业灰绿苎，为0.82%，其次是红尖麻，桐木苎麻，为0.4%～0.8%。添加苎麻各器官干粉提取液的培养液OD600值均比对照组低，在同一品种中，叶片提取液对大肠杆菌和沙门氏菌浓度影响最大，差异最明显（P＜0.05），其OD600值只有0.121～0.245（对照0.394）和0.149～0.263（对照0.402）。1 g/mL 桐木苎麻和乐业灰绿苎的叶片提取液与0.98 mg/mL 抗生素对大肠杆菌的抑制效果差异不明显（P＜0.05），相当于1 kg 的桐木苎麻或乐业灰绿苎的叶粉提取液可替代980 mg 的金霉素，这与我国规定猪饲料中添加1 330 mg/kg 金霉素用于治疗疾病的剂量相近。1 g/mL 桐木苎麻的叶片绿原酸提取液与0.49 mg/mL 抗生素对沙门氏菌的抑菌效果无明显差异，相当于1 kg 桐木苎麻的叶粉提取液可替代490 mg 的金霉素，该剂量处于猪饲料中添加330～670 mg/kg 金霉素用于防止疾病的剂量。

试验选用的抗生素为金霉素，是一种对革兰氏阳性菌，阴性菌，大型病毒，螺旋体等有抑制作用的四环素类广谱抗生素[21]，养殖户用它来预防动物疾病和促进动物生长[22]。但是，侬天涛[23]在研究中发现金霉素的使用在猪肉制品和猪粪便中均有残留，对猪肉的品质和土壤微生物造成不利影响。大量研究表明，绿色植物提取物可抑制和杀灭多种致病细菌，此试验得到了一致的结论。但是通过试验发现，并非绿原酸浓度越高，抑菌效果越好，这可能与提取液中含有其他天然有效杀菌成分有关，因为苎麻叶中除了绿原酸以外，还含有多种黄酮类物质[24]，Cushnie 等[25]发现，富含黄酮类物质的天然植物对耐抗生素的细菌具有良好的抑制作用。王贤芳等[26]用添加6%的苎麻草粉混合饲料与普通蛋鸡混合饲料饲喂，发现蛋鸡死亡率降低50 %。邓罗伟等[27]在研究苎麻草粉不同添加水平（添加5%、10%、15%的苎麻草粉于仔猪的日粮中）对仔猪生产性能的影响中发现取食添加苎麻草粉日粮的仔猪腹泻率和疾病发生率都要比取食未添加组低。由此可以看出，苎麻草粉作为饲料添加剂是完全可行的，此试验仅证明苎麻叶片提取液具有体外抑菌效果，其能否替代动物饲料中的抗生素，还需进行饲喂试验。此试验采用的萃取剂为pH 值4 的50%乙醇，乙醇本身所具有的杀菌能力，但其具有挥发性且作用不稳定，浓缩药液过程中，乙醇挥发较完全，可忽略乙醇对大肠杆菌和沙门氏菌的影响。