红叶粗肋草组织培养叶色影响因素研究

顾梦云，曾伟达，黄明翅，宿庆连，冯肖梅，刘艳艳，张雪莲，周晓云

（广州花卉研究中心，广东 广州 510360）

【研究意义】粗肋草（Aglaonema commutatum）是天南星科（Araceae）粗肋草属（Aglaonema）多年生草本观叶植物［1］，较耐荫，观叶观赏期长［2］，作为家庭小盆栽广泛用于室内。红叶粗肋草是近年来国内较为流行的彩叶品种之一，因其叶片具有较大的红色斑块、中肋粗大、色彩鲜艳亮丽，能够填补淡花季节室内外单调色彩的不足［3-4］，深受广大消费者的喜爱，红叶粗肋草的种植及市场前景看好。随着红叶粗肋草种苗产量的逐年增多，部分红叶粗肋草品种种苗和成品盆花易出现叶色褪红返绿、叶色红艳程度不高等问题，极不利于红叶类粗肋草品种的大量生产和推广。红叶粗肋草繁殖方式主要有分株繁殖、扦插繁殖和组培快繁等，分株、扦插这两种传统繁殖方式因有伤口处理不当容易受病原菌或病毒的重复感染［5］，繁殖速率也相应较低［6］；组培快繁日益成为粗肋草种苗供应的主要方式，但通过组培快繁方式繁育的红叶粗肋草种苗的叶色和红艳度一直存在不稳定性，成为粗肋草种苗繁殖和促进产业发展的限制瓶颈。因此，通过研究红叶粗肋草在组织培养过程中影响叶色的因素，对保持其叶片色彩红艳度、提高组培生产效率具有非常重要的意义。【前人研究进展】高等植物叶片中的光合色素主要包括叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮和花青素等［7］，所含色素的种类、比例和分布位置是影响其叶色变化的直接因素［8-9］，花色素苷是引起植物叶片呈红色的主要物质［10］，其含量变化受植物自身遗传特性［9］、营养物质含量［11］、外界环境光照［12-13］、温度［14］、干旱胁迫［15］等因素影响。王萌等［10］研究发现园林树木叶片呈现不断变红的趋势，主要是由可溶性糖不断积累促进花色素苷合成、花色素苷含量与叶绿素含量比值不断上升造成的；徐莉莉等［11］发现初夏喷施0.3%KH2PO4溶液可促进红叶桃叶片花色素苷含量的增加（保持红色）；杨露等［12］发现充足光照更有利于紫叶风箱果叶片呈色。然而，研究影响红叶类粗肋草叶色因素的相关报道较少，且主要集中在光照和温度条件对彩叶粗肋草小苗和盆花［3,14］生长时期叶色的影响研究方面，而组织培养阶段对其叶色稳定影响因素的研究尚未见报道。【本研究切入点】以红叶的广花红粗肋草为研究对象，针对其组培快繁方式繁育种苗叶色和红艳度存在不稳定性以及组培工厂化生产效率需进一步提高等问题，从红叶粗肋草组织培养的增殖培养基、增殖方式和培养条件（光照）等方面，探究红叶粗肋草组织培养过程中影响叶色的因素。【拟解决的关键问题】探讨在组培环节保持其叶片色彩鲜艳程度的可行性，为进一步稳定红叶类粗肋草高效组培技术及调控叶色提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料广花红粗肋草，为广州花卉研究中心自主选育品种，组织培养材料均以广花红粗肋草茎段为外植体诱导而来。试验于2019 年11 月至2021 年10 月在广州花卉研究中心从化基地组培实验室和温室大棚进行。

1.2 试验方法

1.2.1 增殖培养基比较试验 供试基本培养基包括MS、1/2MS、改良MS（NH4NO3含量减半）3 种，分别添加0、0.5、1.0 g/L K2SO4，共9 种培养基组合（表1）。每种培养基均添加0.2 mg/L KT、3.0 mg/L 6-BA、0.02 mg/L IBA、30 g/L 蔗糖和5.5 g/L琼脂，pH 6.0。

将经过150 d 诱导的广花红粗肋草愈伤组织块剪切成1.5 cm×1.5 cm 大小一致的方形小块，每个小块具4 个长1 cm 小芽，分别接种到9 种培养基中，每瓶4 块，每个处理30 瓶。测量增殖分化的单株苗，每个处理测30 株，测量株高、叶长和叶宽，观察叶色和叶形，将叶片中红色斑块剪出，用叶形纸称重法计算红色斑块占叶面积比例（分＜ 20%、20%～50%、50%～80%、＞ 80% 4个等级）；将分化出的单株苗进行生根培养，40 d 后移植到温室大棚种植，120 d 后统计成苗率。

成苗率（%）＝（叶色红艳、生长状况良好、无变异的正常苗株数/种植总株数）×100

1.2.2 增殖方式比较试验 将灭菌后的广花红粗肋草外植体分别采用愈伤组织增殖、丛生芽增殖两种增殖方式进行增殖扩繁，愈伤组织块剪切成1.5 cm×1.5 cm 大小一致的方形小块，每个小块具4个长1 cm小芽，丛生芽每一丛具4个长1 cm小芽，每个处理10 瓶，后全部转接生根培养，光照强度为3 000 lx，光照时间10 h/d，温度25（±1）℃，40 d 后转移到温室大棚种植，120 d 后统计两种增殖方式繁育苗的成苗率。

1.2.3 光照强度比较试验 将增殖分化和生根培养阶段的广花红粗肋草无菌瓶苗分别放在3 000、4 000 lx 的光照条件下培养，光照时间10 h/d，温度25（±1）℃，每个处理30 瓶。增殖培养50 d后，测量增殖分化出的单株苗株高、叶长、叶宽，每个处理测定30 株；继续转生根培养40 d，观察叶色，统计红色斑块占叶面积比例，然后全部移植到温室大棚，120 d 后按1.2.1 方法统计成苗率。

1.2.4 光质比较试验 设白光（LED 灯）、红光、红光∶蓝光=7 ∶3、红光∶蓝光=5 ∶5、红光∶蓝光=3 ∶7、蓝光、紫光共7 个处理，光照时间为10 h/d，温度为25（±1）℃。将增殖分化和生根培养阶段的广花红粗肋草无菌瓶苗分别放在以上7 种光质处理条件下培养，增殖培养50 d，每个处理30 瓶，然后继续转生根培养40 d。观察组培苗叶色，取从上往下第1～2 片平展叶，测定叶绿素、花色素苷含量。其中，叶绿素提取和含量测定参照《植物生理生化实验原理和技术》［16］方法，花色素苷提取和含量测定参照王佳婉［17］和刘晓东等［18］方法。

试验数据采用Excel 2010 办公软件进行统计整理，利用统计分析软件SAS 9.2 进行方差分析和多重比较（Duncan）。

2 结果与分析

2.1 不同增殖培养基对红叶粗肋草增殖分化苗生长及叶色的影响

9 种不同的培养基配方增殖培养结果（表1）显示，采用3 种不同基本培养基进行增殖培养（未添加K2SO4），MS 培养基和改良MS 培养基培养增殖分化苗的株高、叶长和叶宽均显著高于1/2MS 培养基培养植株。其中，MS 培养基培养的增殖分化苗株高（3.44 cm）、叶长（3.29 cm）、叶宽（2.11 cm）均为最高；叶片红色斑块占比以1/2MS 培养基培养的最大，但该处理组培苗的成苗率最低、为66.67%，而改良MS 培养基培养的成苗率最高、为89.89%。增殖所用基本培养基配方对粗肋草增殖分化苗的生长量、叶色、组培苗成苗率均有影响，且MS 培养基和改良MS 培养基显著优于1/2MS 培养基；1/2MS 培养基和添加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培养基增殖分化苗的叶片红色斑块最多，但由于1/2MS 培养基增殖分化苗矮小且不够健壮、成苗率最低，因此不适于增殖培养。

表1 不同增殖培养基对红叶粗肋草增殖分化苗生长及叶色的影响Table 1 Effects of different culture medium on growth and leaf color of proliferation and differentiation seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

在同一种基本配方培养基中，添加0、0.5、1.0 g/L K2SO4对增殖分化苗的株高、叶长和叶宽的影响差异不显著，但对分化苗叶片红色斑块占比和种植成苗率影响明显。其中，1/2MS 培养基培养植株的红色斑块占比最大，但其种植成苗率均比其他两种基本配方培养基低；且添加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培养基分化苗的红色叶片斑块占比与1/2MS 培养基培养的一样，种植成苗率则在所有配方中最高（90.00%）。

综合上述分析，仅从稳定叶色上考虑，1/2 MS培养基和改良MS 培养基可用于红叶粗肋草增殖培养，但改良MS 培养基成苗率显著高于1/2 MS培养基，且种苗长势整体优于1/2 MS 培养基，尤其是添加了0.5 g/L 的改良MS 培养基分化苗的叶片红色斑块较多，瓶苗植株健壮，种植成苗率最高，增殖培养能保持叶色红艳度，综合比较最优。

2.2 不同增殖方式对红叶粗肋草增殖效率和组培苗生长及叶色的影响

由表2 可知，愈伤组织增殖方式前期经过3次转接，于150 d 后诱导出愈伤组织，愈伤组织再经过2 次增殖培养，增殖系数为1.5～2.0，增殖培养100 d，共计250 d 后分化出芽，每个愈伤组织块可分化出4～5 个芽，芽个数较多（图1A）。丛生芽增殖方式，由外植体直接诱导出芽需50 d，后进行丛生芽增殖培养，增殖4 次，增殖系数为2.5～3.0，增殖培养200 d，共计250 d 后丛生芽较健壮（图1B）。可见，愈伤组织增殖方式前期愈伤组织诱导时间较长，丛生芽增殖方式前期需要进行丛生芽增殖培养，培养250 d 后均可进入生根培养阶段，两种增殖方式的增殖效率差异不大。

从表2 和图1 可以看出，经丛生芽增殖方式培养的红叶粗肋草组培生根苗叶色优于愈伤组织增殖方式，丛生芽增殖方式的红叶粗肋组培生根苗成苗率为83.33%，明显高于愈伤组织增殖方式，且丛生芽增殖方式的组培生根苗穴盘种植后长势较均匀，叶片红艳度高的植株较多，整体叶色优于愈伤组织增殖方式。可见，通过丛生芽增殖方式，其组培分化芽较健壮，能更有效保持叶色稳定性。

表2 不同增殖方式对红叶粗肋草增殖效率和组培苗生长及叶色的影响Table 2 Effects of different propagation modes on proliferation efficiency,tissue culture seedling growth and leaf color of Aglaonema commutatum with red leaves

图1 不同增殖方式对红叶粗肋草组培苗生长及叶色的影响Fig.1 Effects of different propagation modes on the growth and leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

2.3 不同光照强度对红叶粗肋草组培苗生长量及叶色的影响

从表3 可以看出，3 000 lx 光照强度处理红叶粗肋草组培苗的株高为3.42 cm，显著高于4 000 lx 处理，其叶宽1.89 cm、叶长2.49 cm，叶宽/叶长0.77，均小于4 000 lx 光照强度处理；可见，3 000 lx 光照强度处理的组培苗植株较细高、叶面积较小，植株叶片偏长圆型，4 000 lx 光照强度处理的组培苗植株较矮壮、叶面积大、叶片偏圆。叶色方面，3 000 lx 光照强度处理的红叶粗肋草生根苗叶片红色偏淡，红色斑块占比较小（图2A）；4 000 lx 光照强度处理的红叶粗肋草生根苗红色斑块占比大，叶色较红（图2B）。移栽种植后，4 000 lx 光照强度处理的红叶粗肋草生根苗种植成苗率为88.89%，明显高于3 000 lx 光照强度处理。结果表明，4 000 lx 光照强度处理的红叶粗肋草组培苗更加矮壮，生根苗叶片呈色更佳，种植成苗率更高，更适合用于红叶粗肋草组培光照培养。

图2 不同光照强度对红叶粗肋草组培苗叶色的影响Fig.2 Effects of different light intensity on leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

表3 不同光照强度对红叶粗肋草组培苗生长量及叶色的影响Table 3 Effects of different light intensity on growth and leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

2.4 不同光质条件对红叶粗肋草组培苗叶色的影响

从7 个不同光质处理对红叶粗肋草叶片光合色素含量的影响结果（表4）可以看出，经红光照射的组培苗叶片叶绿素a+b 含量最高、为0.058 mg/g，与经白光、紫光照射的组培苗叶片叶绿素a+b 含量差异不显著，但显著高于其他光照处理；其叶片花色素苷相对含量最低、为0.056 Units/g，与经白光、紫光照射的组培苗花色素苷相对含量差异不显著，但明显低于其他光照处理。经红光∶蓝光=3 ∶7 照射的组培苗叶片叶绿素a+b 总含量最低、为0.037 mg/g，与经蓝光照射的组培苗叶绿素a+b 总含量差异不显著，均显著低于其他光质处理；其叶片花色素苷相对含量最高、为0.399 Units/g，均显著高于其他处理。结果表明，红光不利于红叶粗肋草组培苗叶片花色素苷的积累，叶色最差，叶片呈绿白色（图3B）；蓝光在一定光质比例条件下可促进组培苗叶片花色素苷的积累，其中红光∶蓝光=3 ∶7 处理的组培苗叶片花色素苷相对含量最高，叶色红艳（图3E），其次是纯蓝光、红光∶蓝光=7 ∶3、红光∶蓝光=5 ∶5 处理。

图3 不同光质条件对红叶粗肋草组培苗叶色的影响Fig.3 Effects of different light quality conditions on leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

表4 不同光质条件对红叶粗肋草组培苗叶片光合色素含量的影响Table 4 Effects of different light quality conditions on photosynthetic pigment content in tissue culture seedling leaves of Aglaonema commutatum with red leaves

3 讨论

植物组织培养采用的培养基中包含有植物所需的大量元素、微量元素、激素等，同时根据品种特性及生产实际进行优化，如大量元素减半的1/2MS 培养基、减少NH4NO3含量的改良MS 培养基、富K 的MS 培养基等。在本研究中，采用1/2MS 培养基增殖分化的红叶粗肋草组培苗过于弱小、移栽淘汰率高，因此不适合用于红叶粗肋草的增殖培养。大量元素除满足植物生长外，对植株叶片色素含量也有一定影响，植物叶片中很大一部分氮结合在叶绿素中［19］，胡静静等［20］、孙泽晨等［21］研究表明，N 元素与黄连木、红叶南天竹叶片中的叶绿素含量呈正相关，与其叶片中的花色素苷含量呈负相关；K 元素可以通过促进糖的合成和运输，提高红叶石楠叶片中的花色素苷含量［22-23］，李小康等［24-25］研究发现叶面喷施3‰KH2PO4后中红杨叶片颜色更鲜艳。本研究采用增加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培养基增殖培养红叶粗肋草，结果发现增殖分化苗叶色红艳，与上述研究结果较一致。

不同植物可采用不同的组培增殖方式。例如，红掌一般通过诱导愈伤组织再分化不定芽方式进行扩繁［26］；黑果枸杞诱导愈伤组织的分化能力较弱，通过萌发基茎丛生芽的方式增殖效果更好［27］；粗肋草通过愈伤组织增殖和丛生芽增殖两种方式均可进行增殖扩繁［28-31］，本研究中两种方式的增殖效率表现大致相同，但通过丛生芽增殖方式增殖的芽更加健壮、生根苗叶片颜色更稳定、移栽成苗率明显高于愈伤诱导增殖方式，这与刘丽锋等［32］“以大花蕙兰茎尖作为外植体，不经过愈伤组织诱导可直接诱导丛生芽，是一种变异率低的快繁方法”的结论相一致。

光照是影响彩叶植物呈色的重要环境因素，叶片中的色素含量和比例均受光照强度和光质因素影响［3,8］。周佐葡等［3］研究发现，在光照强度1 000～4 000 lx 范围内，随着光照强度增加，如意和烟花红叶粗肋草小苗叶色越艳丽，这与本试验结果一致。本研究发现，4 000 lx 光照强度处理的组培苗相比3 000 lx 光照强度处理的组培苗，叶片呈色更佳。王冬雪［33］研究表明红光处理可以促进枫香幼苗叶片叶绿素合成，与本试验研究结果相似，本研究表明红光条件下，红叶粗肋草组培苗叶片叶绿素总含量最高。范皓月［34］研究发现红光最有利于红叶腺柳叶片呈现红色，蓝光和绿光会促使红叶转绿，本试验中红光不利于红叶粗肋草组培苗叶片花色素苷的积累，叶片呈绿白色，蓝光在一定比例条件下可促进叶片花色素苷的积累，其中以红光∶蓝光=3 ∶7（30%R ∶70%B）处理叶片花色素苷含量最高，与范皓月结论不一致，这可能是由于不同植物的色素系统对不同波长范围的光具有吸收特异性，从而使不同植物对不同光质的反应存在差异［35］。

本试验研究虽然对红叶粗肋草组织培养的增殖培养基、增殖方式和光照条件进行了叶色影响因素分析，但红叶粗肋草的叶色稳定性还受自身遗传特性影响，我们在红叶粗肋草组织培养采用的外植体跟踪调查中发现，采用不同批次外植体组织培养的红叶粗肋草组培苗也存在一定差异，外植体遗传性状稳定是红叶粗肋草品种进行稳定无性繁殖的前提，是保证后续红叶粗肋草种苗和盆花生产质量的重要因素，本研究未涉及红叶粗肋草叶色遗传学研究，后期还应加强对红叶粗肋草叶色基因调控的研究，结合现代生物技术手段，繁育出叶色更加稳定的粗肋草品种和种苗。

4 结论

综上，红叶粗肋草组织培养的增殖培养基、增殖方式、光照条件，均对其叶色有影响。增殖培养基选择0.5 g/L K2SO4的改良MS 培养基，红叶粗肋草增殖分化苗健壮，叶片红色斑块占比在80%以上，成苗率为90.00%；与愈伤组织增殖方式相比，丛生芽增殖方式能更有效保持红叶粗肋草组培苗叶色稳定性，且组培苗移栽成苗率比愈伤组织增殖方式高12.22%；光照强度为4 000 lx，红叶粗肋草组培苗红色斑块面积增大，移栽成苗率达89.99%；合理调节红蓝光比例，可增加红叶粗肋草组培苗叶片花色素苷相对含量，其中红光∶蓝光=3 ∶7 光质处理最佳，叶片叶绿素总含量最低为0.037 mg/g，花色素苷相对含量最高为0.399 Units/g，叶色红艳。