4种常用抗肿瘤中成药注射液的体外细胞毒性实验研究*

易 飞 张 军 蒋莎莎 何 琴

成都市第三人民医院1药学部，2肿瘤科，成都 610031

2011年发布的《医疗机构药事管理规定》中指出：倡导医疗机构根据临床需要建立静脉用药调配中心(室)，危害药品静脉用药应当实行集中调配供应。此处危害药品一般指细胞毒性药品。细胞毒性药品是指在生物学方面具有危害性的药物，多为抗癌药物。这类药品通过皮肤接触或吸入等方式摄入低剂量就能造成包括泌尿、肝肾系统的毒害，还可能致畸或损害生育功能[1]。目前有50余种细胞毒性药物用于肿瘤的临床治疗[2]，但该50余种细胞毒性药物并未包括抗肿瘤中成药注射剂。抗肿瘤中成药注射剂应该按照一般静脉用药配置，还是细胞毒性药物配置，目前还没有依据。目前国家标准中药治疗肿瘤疾病的注射剂品种共计16个[3]，其中四川省可挂网采购的有6个品种，包括艾迪注射液、康莱特注射液、鸦胆子油乳注射液、康艾注射液(用于抗肿瘤或增效放、化疗作用)以及复方苦参注射液和参芪扶正注射液(用于抗肿瘤辅助治疗)。其中艾迪注射液、鸦胆子油乳注射液、康艾注射液及复方苦参注射液静脉输注前需要进行稀释配置。

毒性程度怎样的药品需要进行静脉用药集中调配，目前尚无客观标准，也无评价规范。参照医疗器械生物学评价-体外细胞毒性试验操作流程及评价标准[4]，药物配置时对人体接触部位的直接毒性可类比于医疗器械(如乳胶手套)表面接触部位的直接毒性。乳胶手套的直接细胞毒性是用其浸提液测试细胞的直接毒性，一般使用MTT法，其特点是快速灵敏，试验周期短[5]。但在“医疗器械生物学评价-体外细胞毒性试验操作流程及评价标准”中，还可用细胞相对增殖率来进行细胞毒性分级，其中0级/≥100%为无细胞毒性；1级/80%～99%为轻微细胞毒性；2级/50%～79%为轻度细胞毒性；3级/30%～49%为中度细胞毒性；4级/0～29%为重度细胞毒性[6]。无细胞毒性可参照一般静脉用药配置；轻微及轻度细胞毒性可使用第1类生物安全柜进行静脉用药配置；中度细胞毒性及重度细胞毒性可使用第2类生物安全柜进行静脉用药配置[7]。本实验拟通过CCK8实验测定艾迪注射液、鸦胆子油乳注射液、康艾注射液及复方苦参注射液的细胞相对增殖率，鉴定此4种常用抗肿瘤中成药的直接细胞毒性，以指导是否需要用生物安全柜进行静脉配置。

1 材料与方法

1.1 实验样品

鸦胆子油乳注射液(沈阳药大雷允上药业有限责任公司)、艾迪注射液(贵州益佰制药股份有限公司)、康艾注射液(长白山制药股份有限公司)及复方苦参注射液(山西振东制药股份有限公司)均参照药品说明书中建议配置的浓度范围设置稀释浓度区间。中成药注射液为复合物，其稀释浓度均为溶液体积配比。其中鸦胆子油乳注射液稀释的体积配比梯度为10/250 mL，15/250 mL，20/250 mL，25/250 mL，30/250 mL；艾迪注射液稀释的体积配比梯度为56/500 mL，63/500 mL，71/500 mL，83/500 mL，100/500 mL，125/500 mL；康艾注射液稀释的体积配比梯度为40/500 mL，60/500 mL，80/500 mL，100/500 mL，120/500 mL；艾迪注射液稀释的体积配比为20/200 mL。

1.2 实验用细胞系

小鼠成纤维细胞L929：购自中国科学院细胞库，是L母细胞亚克隆，系W.R.Earle于1940年采取连续细胞培养建立的最早细胞株之一。L细胞株来自100天雄性C3H/An小鼠正常成纤维细胞。

1.3 主要器材和试剂

酶联免疫检测仪(PerkinElmer)，96孔酶标板(costar)，CO2恒温孵箱(Thermo)，无菌超净台(Heal Force)，体外培养用玻璃器皿(HyClone)。

CCK8试剂(biosharp)，细胞培养液(HyClone)，新鲜胎牛血清(四季青)等。

1.4 实验方法

将制备好的细胞悬液接种于96孔板内，待细胞着床后加入供试液，于37℃ 5% CO2孵箱中培养48 h，然后加入CCK8试剂。继续在37℃ 5% CO2孵箱内培养1 h。用酶联免疫检测仪采用双波长的方法测定光密度，通过与对照组的比较得到实验组的增殖率。各对照组均为不加药物处理组，实验组与对照组均平行设置6个复孔。

2 结果

2.1 鸦胆子油乳注射液的体外细胞相对增殖率及毒性

相对空白对照组，鸦胆子油乳注射液稀释体积比为10/250 mL及15/250 mL时，细胞相对增殖率在80%～99%区间，为轻微细胞毒性；药品稀释体积比为20/250 mL、25/250 mL及30/250 mL时，细胞相对增殖率在50%～79%区间，为轻度细胞毒性。见表1。

2.2 艾迪注射液的体外细胞相对增殖率及毒性

相对空白对照组，艾迪注射液稀释体积比为56/500 mL及63/500 mL时，细胞相对增殖率在80%～99%区间，为轻微细胞毒性；药品稀释体积比为71/500 mL、83/500 mL、100/500 mL及125/500 mL时，细胞相对增殖率在50%～79%区间，为轻度细胞毒性。见表2。

2.3 康艾注射液的体外细胞相对增殖率及毒性

相对空白对照组，康艾注射液稀释体积比为40/500 mL、60/500 mL、80/500 mL及100/500 mL时，细胞相对增殖率≥100%，无细胞毒性；药品稀释体积比为120/500 mL时，细胞相对增殖率在80%～99%区间，为轻微细胞毒性。见表3。

2.4 复方苦参注射液的体外细胞相对增殖率及毒性

相对空白对照组，复方苦参注射液稀释体积比为20/200 ml时，细胞相对增殖率在30%～49%区间，为中度细胞毒性。见表4。

表1 鸦胆子油乳注射液各稀释体积比的吸光度值及细胞相对增殖率

表2 艾迪注射液各稀释体积比的吸光度值及细胞相对增殖率

表3 康艾注射液各稀释体积比的吸光度值及细胞相对增殖率

表4 复方苦参注射液稀释体积比的吸光度值及细胞相对增殖率

3 讨论

本研究以各药品说明书建议的稀释体积比设实验组，相对空白对照组，复方苦参注射液的细胞相对增殖率在30%～49%区间；鸦胆子油乳注射液、艾迪注射液的细胞相对增殖率在50%～99%区间；康艾注射液大部分的细胞相对增殖率≥100%；提示康艾注射液40～60 mL配置到250～500 mL液体中，细胞相对增殖率显示为轻微或无细胞毒性；其作为一个益气扶正、增强免疫功能的药物，可以进行一般静脉用药配置。鸦胆子油乳注射液说明书建议配置方法为10～30 mL加入灭菌生理盐水250 mL；艾迪注射液说明书建议配置方法为50～100 mL，加入生理盐水或5%～10%葡萄糖注射液400～450 mL中；该2种药品细胞相对增殖率均显示低浓度时为轻微细胞毒性，稍高浓度为轻度细胞毒性，建议可使用第1类生物安全柜进行静脉用药配置。复方苦参注射液说明书建议药品稀释体积比为20/200 mL，细胞相对增殖率显示为中度细胞毒性，建议可使用第2类生物安全柜进行静脉用药配置。

CCK8法测定细胞相对增殖率只是检测抗肿瘤中成药的直接细胞毒性，而评价一个药物生物学方面的危害除了直接细胞毒性外，评价皮肤接触或吸入等方式摄入低剂量所造成的毒害，以及致畸性或对生育功能的损害可能更有价值；这些方面的评价需要进行动物实验研究，但目前医药行业内均无相关标准及规范，有待进一步通过毒理学实验进行探讨。