龙眼“华农早”×荔枝“紫娘喜”F1真实性鉴定及果实品质性状多样性分析

罗舒文，刘梦秋，刘丽琴，王佳卉，胡小文，王一承，周建男，石胜友

(1 海南大学园艺学院，海口，570228；2 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江，524091；3 重庆市北碚区经济作物技术推广站，重庆，400799)

龙眼DimocarpuslonganaLour.和荔枝LitchichinensisSonn.同属无患子科(Sapindaceae)，分别为龙眼属和荔枝属中最重要的南方经济果树。目前，龙眼品种选育以实生选种和杂交育种为主[1]。由于我国龙眼主栽品种“石硖”(平均单果质量8.5 g)和“储良”(平均单果质量12.0 g)果实偏小，不具备泰国龙眼果大(单果质量≥14.0 g)的优势，在国内外市场上缺乏竞争力，因此迫切需要选育大果形优质龙眼品种。自20世纪80年代末以来，我国已经通过实生选种和杂交育种选育了36个新品种[2]，但仍然没有解决上述问题。因此，利用和挖掘属间优异资源基因，开辟新的育种方法，是实现属种间基因转移的重要途径之一[3]。

1994年澳大利亚McConchie等首次实现了“荔枝×龙眼”的突破，2007年华南农业大学刘成明教授首先在“紫娘喜”荔枝ד石硖”龙眼上获得了2株属间真杂种(“紫石1号”和“紫石6号”)[4-5]，随后开展了早熟龙眼ד紫娘喜”荔枝杂交，获得19株真杂种[6]。2012年本课题组选用“华农早”龙眼为母本，“紫娘喜” 荔枝为父本进行属间杂交，获得杂交苗141株。本研究开发特异性RAPD分子标记鉴定杂交后代的真实性，并对部分杂交后代果实品质性状的多样性进行分析，期望为龙眼优质品种的选育提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2012年，我们通过人工杂交授粉创制了“华农早”龙眼ד紫娘喜”荔枝杂交组合，获得种子203粒，于当年7月播种在中国热带农业科学院南亚热带作物研究所龙眼育种资源圃，获得杂交后代141份，用HZ表示。

1.2 杂种真实性鉴定

1.2.1 提取基因组DNA 2021年5月，采集亲本和杂交群体的叶片，参考Murray等[7]、Stephen等[8]和刘成明等[9]的方法，使用CTAB法提取其基因组DNA，然后使用1%琼脂糖电泳检测DNA，用凝胶成像仪检测DNA的完整性，并用紫外分光光度计进行质量和浓度的初步测定。把检测好的DNA稀释至50 ng/μL后，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 RAPD-PCR扩增 提取好的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。参考Williams等[10]、郭印山等[11]和卢博彬等[12]的方法，PCR扩增反应体系为：反应总体积为25 μL，其中包括10×PCR buffer(15 mmol/L Mg2+)2.5 μL，25 mmol/L MgCl20.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，5 μmol/L 扩增引物1 μL，50 ng/μL基因组DNA 3.0 μL，5U/μL Taq酶0.20 μL，用ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，38 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共进行35个循环；然后72 ℃延伸5 min,于4 ℃保存。PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离，并拍照记录。

1.2.3 杂种后代真实性鉴定 筛选能扩增出父本特征性条带，且在父本自交后代群体中不发生分离的纯合显性RAPD分子标记，用于杂交后代的真实性鉴定；然后利用父本的纯显性标记对杂交后代进行逐一筛选，能扩增出父本特征带的后代鉴定为真杂种，没有父本特征带的后代鉴定为假杂种。

1.3 果实品质性状多样性分析

1.3.1 果实品质性状调查与测定 2019—2021年，连续3年取杂交群体中开花结果的59个单株观测其果实品质性状。在果实成熟期(7月上旬)采收果穗运回实验室，每份材料选取大小一致、无病虫害的果实20个，使用游标卡尺、电子天平和手持式糖度计，调查并测定的数量性状包括：果实质量、纵横侧径，果核质量、纵横侧径，果皮厚度、质量和可溶性固形物。质量性状测定参考《龙眼种质资源描述规范和数据标准》[13]，制订统一标准，根据表型赋值(见表1)。

参考黄爱萍等[14]和石胜友等[15]的方法，对数量性状进行分级，将数量性状分为10级，1级<平均值-2s，10级≥平均值+2s，中间每级相差0.5s，s为标准差。

1.3.2 数据处理与统计分析

使用Excel统计并整理原始数据，计算数量性状的最大值、最小值、平均值、变异系数和多样性指数，计算质量性状的多样性指数，比较性状的变异程度。其中变异系数=标准差/平均值。果实品质多样性用Shannon-Weinner多样性指数(H’)表示。多样性指数计算公式为：H’=-∑PilnPi，式中Pi为某一性状第i类材料份数所占的比例，ln为自然对数[16]。

2 结果与分析

2.1 纯显性RAPD标记筛选

采用30对引物对两个亲本进行扩增筛选，根据父本特异条带的有无，共得到6对引物；然后用这些引物对父本“紫娘喜”自交后代群体进行扩增分析，发现有1个标记的两个特异条带在父本自交群体中均没有发生分离，即引物T4，大概率判断这个标记是纯显性标记，可用于龙眼“华农早”ד紫娘喜”荔枝F1代杂种真实性的鉴定。

2.2 杂种真实性鉴定

应用筛选出的纯显性标记对141个“华农早”龙眼ד紫娘喜”荔枝杂种后代单株进行真实性鉴定，以有无父本特异性条带为判断标准。鉴定结果表明，共有100株能扩增出父本的纯合显性标记，为真杂种；41株未扩增出父本特异性条带，为假杂种。F1真杂种率为70.9%。

2.3 杂交后代果实品质多样性分析

2.3.1 质量性状多样性分析 对F1果实质量性状多样性分析表明，14个质量性状的Shannon-Weaver多样性指数在0.61～1.50之间。其中种子颜色的多样性指数最高，为1.50。离核难易的多样性指数最低，为0.56(见表2)。说明杂交后代的果实质量性状变异类型丰富，果实多样性程度较高。

果实性状：果实形状有近圆形、侧扁圆形、椭圆形3种，其中侧扁圆形和近圆形占绝大部分。侧扁圆形的最多，共有30份，占比50.8%；近圆形的有28份，占比47.5%；椭圆形的仅有1份，占比1.7%。果肩性状主要有单肩隆起、双肩隆起和平。其中果肩平的有42份，占比71.2%;单肩隆起和双肩隆起较少，分别有9份和8份，分别占比15.3%和13.6%。果顶形状分为钝圆、渐圆、圆形、浑圆，主要以圆形和浑圆为主，果顶圆形和浑圆的分别是33份和24份，占比55.9%和40.7%;果顶钝圆和渐圆各有1份，各占比1.7%。

果皮性状：果皮颜色有黄绿色、黄褐色、褐色、黑褐色等4种;其中黄褐色最多，有43份，占比72.9%，褐色有14份，占比23.7%，黄绿色和褐色各有1份，占比1.7%。果皮龟裂纹分明显和不明显，其中龟裂纹明显的较多，有37份，占比62.7%；不明显的有22份，占比37.3%。疣状突起分为无、不明显、较明显和明显;疣状突起不明显的最多，有23份，占比39.0%；疣状突起较明显、明显和无的分别有14、11和11份，分别占23.7%、18.6%和18.6%。果皮粗糙度分光滑、较粗糙和粗糙，果皮较粗糙有23份，占比38.98%；果皮光滑和粗糙各有18份，占比30.51%。

果肉性状：果肉颜色有蜡黄、蜡白、乳白、乳白带血丝4种，其中蜡白色最多，有45份，占比76.3%；乳白的有10份，占比16.9%；蜡黄和乳白带血丝分别有2份，占比3.4%。果肉质地分为软和脆两种，果肉脆的有37份，占比62.7%；果肉软的有22份，占比37.3%。果汁分为少量、中量和多量3种;果汁中量的有27份，占比45.76%；果汁多量的有18份，占比30.51%；果汁少量的有14份，占比23.73%。果肉透明度分不透明、半透明和透明3种，主要为不透明和半透明，分别有34份和22份，分别占比57.6%和37.3%；透明有3份，占比5.1%。化渣程度分化渣、略带渣和不带渣，略带渣和不带渣的较多，分别有26份和24份，分别占比44.1%和40.7%；化渣的有9份，占比15.3%。

种子性状：离核难易情况分为易、较易和难，离核易有45份，占比76.3%；离核较易和难分别有13份和1份，分别占比22.0%和1.7%。种子颜色较丰富，分为红褐色、赤褐色、浅褐色、深褐色、紫黑色和漆黑色6种。其中紫黑色最多，有24份，占比40.68%；其次是深褐色和漆黑色，分别有16份和8份，分别占27.12%和13.56%；赤褐色、红褐色和浅褐色较少，分别有5份、4份和2份，占比8.47%、6.78%和3.39%。种子颜色的多样性指数最高，为1.50，说明杂交后代的种子颜色具有丰富的多样性。

2.3.2 数量性状多样性分析 13个数量性状的变异系数在6.58%～19.36%之间，Shannon-Weaver多样性指数变化范围为1.15～2.20，高于质量性状的多样性指数，表明杂交后代果实的数量性状比质量性状多样性丰富。其中果肉质量和果皮质量的变异系数较高，分别为19.36%和18.21%；果皮质量和果核质量的多样性指数较高，分别为2.20和2.19；果核侧径和可食率的变异系数较低，分别为8.44%和6.58%，它们的多样性指数也较低，分别为1.16和1.15。

果实大小：单果质量平均值为9.36 g，标准差为1.44，变异系数为15.41%，多样性指数为1.77；单果质量最大的是HZ131，达到13.22 g；单果质量最小的是HZ61，仅有6.89 g。单果纵径的平均值为24.20 mm，标准差为2.06，变异系数为8.53%，多样性指数是1.66；单果纵径最大的是HZ105-2，为27.00 mm；最小的是HZ158，为11.92 mm。单果横径的平均值为26.26 mm，标准差为2.27，变异系数为8.66%，多样性指数为1.92；单果横径最大的是HZ131，为30.18 mm；最小的是HZ158，为14.22 mm。单果侧径的均值为23.35 mm，标准差为2.03，变异系数为8.72%，多样性指数为1.66；单果侧径最大的是HZ131，为27.33 mm，最小的是HZ158，为11.15 mm。2021年，我们发现了1个优株单果质量平均为17.6 g，最大达到19.3 g。

果核大小：平均果核质量为1.54 g，标准差为0.24，变异系数为15.75%，多样性指数为2.19；其中果核质量最大的是HZ127，为2.10 g；最小的是HZ176，为1.11 g。果核纵径的平均值为13.87 mm，标准差为1.19，变异系数为8.58%，多样性指数为1.27；果核纵径最大的是HZ127，为15.61 mm；最小的是HZ105-2，为7.02 mm。果核横径的平均值为13.75 mm，标准差为1.28，变异系数为9.29%，多样性指数为1.42；果核横径最大的是HZ127，为16.33 mm；最小的是HZ105-2，为7.02 mm。果核侧径的平均值为11.45 mm，标准差为0.97，变异系数为8.44%，多样性指数为1.16；果核侧径最大的是HZ127，为13.32 mm；最小的是HZ105-2，为5.08 mm。

果皮性状：果皮厚度的均值为0.62 mm，标准差为0.10，变异系数为16.44%，多样性指数是1.39；果皮厚度最大的是HZ123，为0.82 mm；最小的是HZ125-2，仅0.26 mm。果皮质量的平均值是1.50 g，标准差是0.27，变异系数达18.21%；其中果皮质量最大的是HZ131，达2.32 g；最小的是HZ61，为0.98 g。

果肉性状：果肉质量均值为6.33 g，标准差是1.22，变异系数达19.36%，多样性指数为2.15；其中果肉质量最大的是HZ9，为9.28 g；最小的是HZ123，为4.11g。可溶性固形物均值为19.47%，标准差是2.30，变异系数为11.84%，多样性指数为2.09；其中可溶性固形物含量最高的是HZ40，达23.75%；含量最低的是HZ11，仅12.84%；可溶性固形物含量大于20%的有22份，占比37.29%。说明杂交后代在可溶性固形物含量上表现出不同程度的变异和多样性。可食率的平均值为67.18%，标准差是0.04，变异系数最低，仅6.58%，多样性指数也最低，为1.15；其中HZ9的可食率最高，为75.34%；HZ123的可食率最低，为54.78%；可食率大于70%的有16份，占比27.12%(见表3和图3)。

图3 “华农早”龙眼ד紫娘喜”荔枝杂交后代F1果实与其最大单果

表3 “华农早”龙眼ד紫娘喜”荔枝杂交后代单株(HZ)果实数量性状

3 结论与讨论

杂种鉴定是远缘杂交育种的重要环节，特别是荔枝和龙眼都具有花性复杂、多批次开花的特点，很容易发生自交而产生假杂种[4]。龙眼中常用的分子标记有AFLP、RAPD、SSR等，RAPD分子标记具有操作简便、所需DNA样品少、分析速度快、多态性丰富的优点[17]。本研究筛选了父本纯显性RAPD分子标记，用于 “华农早”龙眼ד紫娘喜”荔枝杂交群体的真实性鉴定，鉴定结果共获得真杂种100株，F1真杂种率为70.9%。

杂交后代果实品质性状的鉴定评价是种质资源创新利用的重要手段[18]。龙眼的果实品质性状包括果实大小、果皮厚度、果肉颜色、可溶性固形物含量等，这些性状是选育龙眼种质新材料的重要指标。本研究采用Shannon-Weaver多样性指数(H′)，对真杂种中59份开花结果单株的14个质量性状和13个数量性状进行了多样性分析。数量性状的多样性指数(1.16～2.20)比质量性状的多样性指数(0.61～1.50)高，表明杂交后代果实的数量性状比质量性状多样性丰富。其中果皮质量和果核质量的多样性指数较高，分别为2.20和2.19；离核难易情况的多样性指数最低，为0.56。变异系数大小反映品种固有特征及生物产品的个体差异范围[19]。13个数量性状的变异系数在6.58%～19.36%之间，表明杂交后代间果实品质多样性较高，发生了不同程度的遗传变异，为将来筛选龙眼种质新材料提供了基础。

由于龙眼与荔枝杂交后代表现出典型的偏母遗传现象[20]，所以“华农早”龙眼ד紫娘喜”荔枝F1果实与龙眼相似。在杂交后代中平均单果质量超过母本“华农早”(9.1 g)的有33株，占55.93%。杂交后代中平均单果质量超过我国龙眼主栽品种“储良”(12.0 g)的有3株，分别为HZ3、HZ9、HZ131。2021年，我们发现的1个优株平均单果质量(17.6 g，最大单果质量19.3 g)大于“大乌圆”龙眼(16.3 g)，且可溶性固形物含量(≥20.0%)、可食率(≥70%)等品质性状都优于“大乌圆”，有望应用于解决龙眼大果优质种质缺少的问题。由于这个单株只有1年的数据，因此未列入本论文中的多样性分析。