猪源肠外致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定与药敏试验

苏梦茹，叶 超，赵学亮，冯 航，王 娟，杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100

大肠埃希菌(Escherichiacoli)俗称大肠杆菌，是一种两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌。其根据致病力特性主要分为3个亚群，即非致病性的共生菌、肠内致病性大肠埃希氏菌(Intestinal pathogenicEscherichiacoli,IPEC)和肠外致病性大肠埃希氏菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,Ex PEC)[1]。研究指出，Ex PEC是一类能引起人和动物肠外组织感染的重要人畜共患病病原体，不仅可以定植在肠道，还能引起局部肠道外的感染如脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症等疾病[2]。近年来经济动物养殖过程中的Ex PEC的发病率、病死率均有上升的趋势，给养殖业带来了巨大损失[3]。2021年6月，陕西省某猪场仔猪发生肺炎，主要表现精神倦怠、咳嗽和呼吸不畅等症状，临床上仔猪体格消瘦、生长发育不良，给养殖场带来经济损失。本研究对送检的患病仔猪进行剖检，进行病原菌的分离和鉴定，确定为肠外致病性大肠埃希氏菌，并对其耐药性进行分析，为临床病原诊断治疗提供基础资料和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 陕西省某猪场精神不佳、生长缓慢、体格消瘦并伴有肺炎等临床症状的仔猪，剖检后肺脏充血水肿、暗红，无菌采集仔猪病变肺部组织低温送至实验室。

1.1.2 主要试剂 麦康凯培养基、CAMHB培养基和普通营养琼脂培养基，青岛海博生物技术有限公司产品；2×TaqPCR StarMix，北京Genstar生物科技有限公司产品；细菌微量生化反应管，杭州滨和微生物试剂有限公司产品；抗菌药物，上海源叶生物科技有限公司产品；

1.1.3 实验动物 体格均匀的昆明小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.4 仪器设备 细菌培养96孔板，广州洁特生物过滤股份有限公司产品；电子天平，奥豪斯仪器有限公司产品；超净工作台，苏净集团安泰公司产品；恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据文献[4-7]设计通用引物扩增16S rRNA基因、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetC、TEM、SHV、OXA、CTX等10种耐药基因引物(表1)，送至西安擎科泽西生物技术有限责任公司合成。

表1 耐药基因PCR引物

1.2.2 细菌分离鉴定 将无菌采集的猪肺组织接种到血平板上，将平板放置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，挑取血平板上典型的单个灰白色大菌落进行革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。若为纯培养物，将其接种于麦康凯培养基上，37 ℃恒温培养24 h。

1.2.3 生化试验 将分离到的细菌纯化培养，选取葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、尿素、鸟氨酸脱羧酶、甘露醇、山梨醇、枸橼酸盐、硫化氢、尿素、甲基红、VP和吲哚等生化反应管，无菌接种针挑取纯化后的菌落接种于细菌微量生化反应管，将其放置于37 ℃恒温培养箱中，24 h后观察结果。

1.2.4 16S rRNA序列PCR鉴定 刮取LB平板上的菌落至生理盐水中，煮沸法提取细菌DNA，对其16S rRNA序列进行PCR鉴定，PCR反应条件为20 μL体系：10 μL 2×Mix预混液，上、下游引物各1 μL，模版DNA 1 μL，双蒸水补至20 μL。反应程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。预期扩增片段为1 600 bp，PCR阳性产物送至西安擎科泽西生物技术有限责任公司测序，测序结果上传NCBI网站进行序列比对，确定菌种。

1.2.5 药敏试验 根据CLSI文件[8]所述药敏试验标准，利用微量肉汤稀释法测定菌株对选用抗菌药物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，细菌用96孔板每孔加入50 μL CAMHB培养基，并将氨苄西林、复方阿莫西林、庆大霉素、四环素、替加环素、头孢噻呋钠、头孢他定、恩诺沙星、氟苯尼考、美罗培南、多黏菌素B和磺胺异恶唑等12种抗菌药物进行浓度梯度稀释。在LB琼脂平板上刮取大肠埃希氏菌菌落，生理盐水稀释为麦氏浊度为0.5的菌液。质控菌为大肠埃希氏菌25922，每60 μL菌液与5 mL药敏接种培养液混合均匀后，按照每孔50 μL加入96孔细菌培养板，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h。通过观察96孔细菌培养板内大肠埃希氏菌生长情况，统计试验菌株对所选抗菌药物的最小抑菌浓度，并根据CLSI文件判断试验菌株对所选抗菌药物敏感性。

1.2.6 小鼠致病性试验 将大肠埃希氏菌分离株接种于血平板上，37 ℃恒温培养24 h，用生理盐水冲洗收集菌液，调节菌液浓度为1×108CFU/mL。选取体格健康状态均匀的昆明小鼠10只，随机分为试验组和对照组，每组5只，试验组小鼠腹腔接种大肠埃希氏菌液0.3 mL/只，对照小组注射等量的生理盐水。室温下分笼饲养，每日观察小鼠的健康状况。小鼠死亡后立即剖检，观察各脏器病变，无菌摘取小鼠肺脏，切面涂抹在伊红美蓝琼脂培养基上，将培养基37 ℃恒温培养24 h，观察细菌形态。

1.2.7 耐药基因检测 参照表1所述引物的文献方法，对大肠埃希氏菌分离株进行tetA、tetB、tetC、sul1、sul2、sul3、sul、TEM、SHV、OXA、CTX等10种耐药基因进行PCR鉴定。PCR产物用15 g/L琼脂糖电泳进行检测，凝胶成像系统观察并记录结果。

2 结果

2.1 分离鉴定结果

2.1.1 细菌染色镜检结果 病变的肺脏组织划线接种到血平板37 ℃培养24 h后有形态单一的菌落生长，表现为湿润、圆形隆起的灰白色菌落，直径约1 mm左右，不溶血；在麦康凯上呈现红色、表面光滑、边缘整齐的圆形菌落，革兰氏染色镜检可见分离株为革兰氏阴性、散在或成对两端钝圆的短杆菌(图1)。

A.血平板；B.麦康凯培养基；C.显微镜镜检观察(1 000×)

2.1.2 生化特性 分离菌株的生化特性结果见表2，其生化试验结果符合大肠埃希氏菌的生化特性。

表2 分离菌株的生化特性

2.1.3 16S rRNA基因测序与分析 16S rRNA序列经PCR鉴定扩增出预期大小的目的条带(图2)，PCR产物送至生物公司测序，测序结果利用NCBI的Blast在线功能，比对发现分离株与NCBI登录号MN208080.1的菌株具有98%的同源性。

M.DNA 标准DL 2 000;16S rRNA；+.阳性对照;-.阴性对照

2.2 细菌最小抑菌浓度结果

根据CLSI文件利用微量肉汤稀释法测定药物MIC值，根据表3药敏结果显示，大肠埃希氏菌分离株对氨苄西林、复方阿莫西林、庆大霉素、四环素、头孢噻呋钠、头孢他啶、恩诺沙星和氟苯尼考、磺胺异恶唑等9种抗菌药物表现耐药，对替加环素、美罗培南以及多黏菌素B等3种抗菌药物显示敏感。

表3 分离株的最小抑菌浓度

2.3 小鼠致病性试验

腹腔接种大肠埃希氏菌分离株培养物12 h后，试验组小鼠出现明显的精神沉郁、食欲减退、被毛蓬乱和呼吸急促等症状，24 h～36 h后试验组全部小鼠死亡，对照组小鼠精神状态良好。无菌剖检死亡小鼠后发现，小鼠的肠道、肝脏和肺脏有不同程度的出血，肠道呈暗紫色、松软状态(图3A)；肺脏红肿、出血(图3B)。将肺脏用无菌剪刀裁剪剖面接种到伊红美蓝培养基后，回收到带有金属光泽的紫黑色菌落(图4)，染色镜检为革兰氏阴性的短杆菌，PCR鉴定为大肠埃希氏菌。

A.小鼠肠道病变;B.肺脏病变

图4 伊红美蓝培养基上肺脏切面培养的大肠埃希氏菌

2.4 耐药基因鉴定结果

经鉴定，分离到的大肠埃希氏菌携带sul3、tetA和TEM3种耐药基因(图5)，未检测到其他7种耐药基因。

M.DNA 标准DL 2 000;1.sul1；2.sul2；3.sul3；4.tetA；5.tetB；

3 讨论

猪大肠杆菌病是由于感染某些致病性大肠埃希氏菌而发生的一种急性传染病，主要临床症状是肠毒症、肠炎等，多见于仔猪，发病后会严重损害养殖业经济效益，尤其是肠外致病性大肠埃希氏菌的潜在危害性[9-10]。临床上由Ex PEC引发的脑膜炎、腹膜炎、肺炎、败血症等疾病常不能及时的确诊和治疗，往往给养殖业带来不少损失。本研究对送检有肺炎症状的仔猪进行剖检和病原的分离鉴定，在病变的肺脏中分离到大肠埃希氏菌，且经小鼠致病性试验也验证了该菌可引起肺部炎症，判定该大肠埃希氏菌分离株为肠外致病性大肠埃希氏菌。

为了临床上更合理的用药，利用微量肉汤稀释法对该大肠埃希氏菌分离株进行了药敏试验，药敏结果显示，该大肠埃希氏菌分菌株对临床常用的几种抗菌药物都有不同程度的耐药。其中对氨苄西林(β-内酰胺类抗菌药物)、复方阿莫西林(青霉素类)、庆大霉素(氨基糖胺类)、四环素(四环素类)、头孢噻呋钠和头孢他啶(头孢菌素类)、恩诺沙星(喹诺酮类)、氟苯尼考(氯霉素类)、磺胺异恶唑(磺胺类)等9种药物均表现耐药，对替加环素、美罗培南以及多黏菌素B显示敏感。试验分离到的猪源大肠埃希氏菌其耐药特性与丁建华等[11]研究的猪源大肠埃希氏菌的耐药性相似，对阿莫西林、氨苄西林、四环素等抗菌药物表现多重耐药。据报道，临床上猪源Ex PEC的耐药状况已经不容乐观。张璇等[12]发现分离到的134株猪源Ex PEC的耐药谱高达59种，98%的菌株为多重耐药菌株，耐受10种抗菌药物的菌株高达92%，其中氨苄西林、阿莫西林、环丙沙星、四环素和磺胺异恶唑等药物的耐药率都在85%以上。不仅如此除了青霉素类、四环素类、β-内酰胺和磺胺类等药物耐药严重外，由于抗菌药物的不合理使用，人们发现临床上大肠埃希氏菌对于头孢类等抗菌药物耐药性也呈增加的趋势[13-15]。目前Ex PEC的临床分离情况和耐药范围愈加严重，本研究结果可为养殖过程中发生的肠外致病性大肠杆菌病的诊断和治疗提供参考。