松辽黑猪METTL23 基因内含子4 多态性及其与繁殖性状的关联分析

张 琪，于永生，刘庆雨，高 一，李 欣，刘洪亮，张 庆，张志彬，李兆华，张云鹏，张净搏，李 娜*，张树敏*

（1.吉林省农业科学院，吉林长春 130124；2.公主岭国家农业科技园区飞马斯牧业有限公司，吉林公主岭1 361001）

松辽黑猪是以长白猪为第一父本、杜洛克猪为第二父本、吉林本地民猪为母本历经23 年培育出的我国北方第一个瘦肉型母系新品种，因其适应性强、耐粗饲、瘦肉率高及肌内脂肪含量适当等优点越来越受到养殖者和消费者的喜爱。2014—2016 年农业农村部（原农业部）将松辽黑猪作为主要推广品种，在全国范围内推广。但松辽黑猪与其亲本民猪比较，繁殖性状仍然有选育提高的空间。猪的生产性状中繁殖性状是遗传力较低的性状，采用常规选择育种法，遗传速度较慢，如果将常规方法与标记辅助法结合起来，可以显著提高改良速度。

猪的甲基转移酶23（Methyltransferase-like 23，）基因位于12 号染色体上，可编码190 个氨基酸，全长6 545 bp，共5 个外显子。属于I 型精氨酸甲基转移酶（Arginine Methyltransferases，PRMTs)，参与调控RNA 代谢、细胞增殖以及相关信号转导等生物学过程，在动物的生长发育过程中行使着不可替代的作用。有研究表明PRMTs 的甲基化修饰在小鼠胚胎着床方面起到非常重要的作用。关于基因的研究多是与人类智力相关联，与猪繁殖性状选育方面相关性的研究鲜有报道。

本实验采用直接测序的方法来检测松辽黑猪基因内含子4 多态性，并分析多态性位点与相关繁殖性状（总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数、初生重、3 周龄重、断奶重、乳头数）间的相关性，为松辽黑猪繁殖性能改良和在养猪生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 随机选取178 头经产健康松辽黑猪母猪（由公主岭飞马斯种猪场提供），用耳钳夹取黄豆粒大小耳组织，浸入含75%酒精的2 mL 离心管中，样品贮存在实验室冰箱备用，同时统计收集所选母猪的繁殖数据。

1.2 主要试剂及设备 基因组DNA 提取试剂盒（Axygeno）；2×Taq MasterMix（康为世纪生物）；PCR 仪（上海伯乐生命医学）；电泳仪；凝胶成像分析仪。详细信息见参考文献。

1.3 松辽黑猪耳组织DNA 抽提 按照DNA 抽提试剂盒说明书，对松辽黑猪耳组织DNA 进行抽提，并检测DNA 的浓度及OD 值，浓度应大于50 ng/μL，OD值在1.8～2.2 范围之内。采用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA 质量进行检测，电泳条带应清晰并且无杂带。

1.4 引物设计及合成 使用Ensemble 软件查找猪基因DNA 序列（ENSSSCT00000025222.3），Primer Premier 5.0 软件设计引物，引物序列为：F：5'-CT GGAAATCTGTCAGCGTA-3'；R：5'-TTTGTTGAGGTC GTGGGTA-3'，由苏州金唯智生物科技有限公司完成。预计扩增片段长度为898 bp。

1.5 PCR 扩增及SNP 位点检测 将提取并经过鉴定质量好的178 头松辽黑猪DNA 做为模板，进行PCR 扩增。PCR反应体系20 μL：DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，ddHO 8 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34 个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序结果使用DANMAN 与Chromas 软件进行分析。

1.6 统计学分析 统计基因型，计算遗传纯合度（Ho）、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）和多态信息含量（PIC）。

式（1）、（4）中：n 为等位基因数目，i 为第i 个等位基因，j 为第j 个等位基因，P、P为计算的等位基因频率。

实验数据通过Excel 进行整理后，运用SPSS 19.0软件中单因素方差进行分析，以确定基因不同基因型与松辽黑猪繁殖性状的相关性，<0.05 为差异显著，<0.01 为差异极显著。

2 结果

2.1 PCR 扩增产物电泳结果 松辽黑猪基因PCR 扩增产物经1%琼脂糖电泳检测结果如图1 所示，可见该扩增产物与预期扩增片段大小一致，无非特异性条带，可以进行后续实验。

图1 METTL23 基因内含子4 引物PCR 扩增产物

2.2 PCR 产物测序结果分析 由图2 可知，在基因内含子4 第43 位上发现G/A 突变。共发现2 种等位基因（G 和A）及3 种基因型（GG、GA 和AA）（图3）。

图2 松辽黑猪METTL23 基因内含子4 序列比对结果

图3 松辽黑猪METTL23 基因内含子4 不同基因型测序图

2.3 松辽黑猪基因型频率和基因频率 根据测序结果计算出松辽黑猪基因G/A 位点的基因型频率与基因频率，结果见表1。AA 基因型个体数量最多，为优势基因型。G、A 等位基因频率分别为11.24%和88.76%，A 为优势等位基因。适合性卡方检验表明，松辽黑猪基因内含子4 的G43A 位点符合Hardy-Weinberg 平衡状态。

表1 松辽黑猪METTL23 基因内含子4 的基因型频率和基因频率

2.4 松辽黑猪基因群体遗传多样性 由表2可知，群体遗传杂合度（0.199 5）数值较低，说明在松辽黑猪群体中该位点变异程度较小；多态信息含量为0.179 6，属于低度多态。

表2 METTL23 基因G/A 位点在松辽黑猪中的遗传特性

2.5 松辽黑猪基因多态性与繁殖性状的关联分析基因内含子4 的G43A 位点GG 基因型个体3 周龄重、断奶重显著高于AA 基因型个体；GA 基因型的总产仔数、产活仔数和断奶仔猪数均高于GG、AA 基因型个体，但差异不显著。

表3 松辽黑猪METTL23 基因不同基因型与繁殖性状的相关性

3 讨论

基因是精氨酸甲基转移酶中的一种，它在调节早期胚胎发育和器官生长中起着重要作用。Blance 等报道，基因在胚胎发育的桑葚胚和囊胚期表达量升高。Hashimoto 等研究发现，将精氨酸甲基转移酶家族成员敲除的小鼠突变体出现胚胎发育异常和死亡的现象。同时，Bao 等发现精氨酸甲基转移酶在小鼠睾丸中也高表达。Yu 等通过抑制小鼠胚胎成纤维细胞中精氨酸甲基转移酶的表达，导致了甘氨酸-精氨酸结构的低甲基化，从而使DNA 自发性损伤，使细胞周期进程延迟，导致染色体非整倍数或多倍数呈现，引起胚胎死亡。雌激素受体（ESR）在哺乳动物生殖中通过上下级联信号转导发挥重要的生物学作用。PRMT1 能够瞬时使ESR内的精氨酸260DNA 结合域甲基化。ESRα 甲基化可以调控雌激素反应，促使复合物解离，进一步使下游的相关酶失活，证实了基因在调节雌性动物繁殖性能方面起着重要作用。以上研究说明精氨酸甲基转移酶在生殖过程中具有重要作用。

本研究通过Sanger 直接测序对松辽黑猪群体基因内含子4 进行SNP 位点检测，发现基因内含子4 序列存在G/A 突变，检测出基因型3 种（GG、GA 及AA），其中AA 为优势基因型，A 为优势基因。本实验研究发现，基因突变位点遗传杂合度相对较低，说明该位点在松辽黑猪检测群体中的遗传变异程度偏低，且属于低度多态。对G43A 位点与松辽黑猪繁殖性状关联分析发现，GG 基因型3 周龄重、断奶重显著高于AA 基因型。GA 基因型的总产仔数、产活仔数和断奶仔猪数高于GG、AA基因型，差异不显著。

目前未见基因在不同品种猪上多态性与繁殖性状相关研究的报道。研究表明，同一基因在不同群体或不同品种（品系）之间存在一定差异。由于繁殖性状受多因素影响，因此目前尚不能确定基因是影响松辽黑猪繁殖性状的主效基因或是与控制繁殖性状主效基因连锁的基因，相关实验结果还需要在该品种猪更多群体间及不同品种中进行验证。

4 结论

本研究对松辽黑猪基因内含子4 进行了PCR 扩增及Sanger 直接测序，经分析检测到G/A 突变。该位点与松辽黑猪3 周龄重和断奶重显著相关。但该突变位点能否作为松辽黑猪繁殖性状的遗传标记，需要更大的群体进一步验证。