昆明小鼠与西门塔尔牛异种体外受精初步研究

张立苹，华再东，肖红卫，任红艳，朱 喆，毕延震

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064）

体外受精（In Vitro Fertilization，IVF）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境下，通过人工手段完成受精过程的技术，此技术成功于20 世纪50 年代，在最近20 年发展迅速，现已日趋成熟并成为一项重要且常规的动物繁殖生物技术。IVF 技术不仅广泛应用于畜牧业生产，同时成为研究动物发育生物学如体细胞重编程、胚胎干细胞及性别控制等的重要辅助手段。此外，利用IVF 技术检测精子受精能力也成为可能。Yanagimachi利用无透明带地鼠卵进行人精子IVF，成功建立异种IVF 方法，即精子穿透无透明带地鼠卵试验（简称精子穿透试验，Sperm Penetration Assay，SPA），并证实了此方法可作为预测男性生育能力的有效模型。由于人卵母细胞比较难获得，目前，SPA 已经被广泛应用于人精子受精能力和受精潜能验证试验中，并在临床上被作为一种检测生育能力的重要手段，同时，SPA 还被广泛应用于精子运动与受精的关系、精子获能的生理机制等基础研究中。

目前，主要以仓鼠卵母细胞为受体进行异种动物IVF 研究，但仓鼠的成本较高、饲养条件更为苛刻。因此，本研究选择成本较低、比较容易饲喂的昆明小鼠，获取其卵母细胞为受体，对西门塔尔牛冷冻精子进行IVF，旨在建立适用于本实验室的昆明小鼠-西门塔尔牛IVF体系，为研究雄原核的形成和受精卵的发育机理提供试验素材。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和精子来源 实验所用昆明小鼠购买于武汉市疾控中心；实验所用精液为西门塔尔奶牛冷冻精液，购买于武汉市奶牛改良站。

1.1.2 主要试剂与仪器 西门塔尔牛体外受精液BO 液配方：6.55 mg/mL 氯化钠+0.3 mg/mL 氯化钾+0.249 mg/mL氯化钙+0.0497 mg/mL 氯化镁+0.0869 mg/mL 磷酸二氢钠+3.104 mg/mL 碳酸氢钠+2.5 mg/mL 葡萄糖+0.055 mg/mL 丙酮酸钠+0.065 mg/mL 青霉素+0.05 mg/mL硫酸链霉素。西门塔尔牛体外受精获能液BO-A 液配方：BO 液+5 mmol/L 咖啡因+10 mg/mL 肝素钠+3 mg/mL 牛血清白蛋白。奶牛胚胎培养液CRlaa 配方：114.7 mmol/L氯化钠+3.1 mmol/L 氯化钾+26.2 mmol/L 碳酸氢钠 +0.4 mmol/L 丙酮酸钠+5.0 mmol/L 乳酸半钙+3 mg/mL牛血清白蛋白+1.0 mmol/L-谷氨酰胺。小鼠胚胎培养液M2、小鼠IVF 受精液HTF 购买于Sigma 公司；超排激素人绒毛膜促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）购买于宁波第二激素厂。Olympus IX70 倒置荧光显微镜（Olympus 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 获取昆明小鼠成熟卵母细胞 选取6～10 周龄昆明雌鼠控光（14 h 光照，10 h 黑暗）饲养1～2 周后，按照 10 IU/只的剂量腹腔注射PMSG，注射 46～48 h 后，按照10 IU/只腹腔注射hCG 进行超排。超排20～22 h 后，采用颈椎脱臼法处死超排小鼠，75%酒精消毒后切开腹腔，剪下输卵管及连接的一小段子宫，置于有杜氏磷酸缓冲盐液（DPBS）的平皿中，体式显微镜下用带针头的一次性1 mL 注射器刺破输卵管壶腹部，获得超排卵母细胞，倒置显微镜下观察，获得带有第一极体的成熟卵母细胞。

1.2.2 西门塔尔牛优质精子获取 采用上浮法获取优质精子，具体操作方法：从液氮罐取冻精细管置37℃水浴中30～40 s 快速解冻，75%酒精消毒后剪开细管，将精子移入含1 mL BO 的离心管中，用1 mL 量程移液枪轻轻吹打，上下颠倒几次，置于二氧化碳培养箱中静置20～30 min，使精子上浮，上浮后的精子600×g 离心5 min，弃上清，重复3 次，获得所需优质精子。优质精子的选择标准：倒置显微镜400×视野下观察，形态正常、直线前进运动的精子占比90% 以上可用于IVF，反之弃掉，重新准备。

1.2.3 IVF 及受精卵的体外培养 实验设计1：比较体外受精液对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响。实验分为2 个处理组，其中A 组将带有第一极体的成熟昆明小鼠卵母细胞置于BO-A 液中平衡30 min，BO 液处理西门塔尔牛精液，IVF 微滴采用BO-A 液；B 组中，将成熟的昆明小鼠卵母细胞置于HTF 中平衡30 min，HTF 液处理西门塔尔牛精液，IVF 微滴采用HTF 液。体外受精用精子的工作浓度为3×10个/mL，采用西门塔尔牛IVF 条件进行精卵孵育6 h（39℃，5% CO，饱和湿度）。IVF 6 h 后，用移液器轻轻吹打卵母细胞，除去浮在卵母细胞表面的精子，倒置显微镜下观察雄原核形成情况。将观察到带有雄原核的卵母细胞用CRlaa 洗涤3 次后，置于CRlaa 中采用奶牛胚胎培养条件培养（39℃，5%CO，饱和湿度）。

实验设计2：比较IVF 条件对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响。在实验1 结果的基础上，采用同实验设计1 IVF 相同的方法进行IVF 实验，采用西门塔尔牛体外受精液（BO 液）和获能液（BO-A 液），IVF 条件全部调整为昆明小鼠卵母细胞的培养条件，即37℃，5% CO，饱和湿度。并将观察到雄原核的卵母细胞用M2 洗涤3 次后，置于M2 中采用小鼠胚胎培养条件培养（37℃，5% CO，饱和湿度）。

实验设计3：对比透明带对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响。在实验1 和实验2 基础上，用0.25% 链霉蛋白酶去除昆明小鼠卵母细胞透明带后，用西门塔尔牛体外受精液（BO 液）处理冷冻精子，并采用西门塔尔牛获能液（BO-A 液）和培养条件（39℃，5% CO，饱和湿度），采用同实验设计1 中IVF 相同的操作方法进行IVF 实验，对比透明带对雄原核形成的影响。

1.3 统计分析 试验每重复1 次均为同一批次试验，使用相同来源的卵巢和试验条件，所有试验至少重复4 次。数据采用检验。

2 结果与分析

2.1 受精液对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响 表1显示，受精液和获能液显著影响异种动物IVF 结果，采用西门塔尔牛精子受精液和获能液，雄原核形成率高于采用昆明小鼠受精液组（<0.05），且卵裂率达26.09%。

表1 受精液对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响

2.2 受精条件对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响 表2 显示，采用西门塔尔牛体外受精条件的雄原核形成率（12.34% vs 3.55%）和卵裂率均（26.32% vs 0%）高于小鼠胚胎培养条件（<0.05）。

表2 受精条件对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响

2.3 透明带对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响 由表3中可知，用0.25% 链霉蛋白酶去除昆明小鼠卵母细胞透明带后，更有利于西门塔尔牛精子附着并穿入卵内，进而形成雄原核，去除透明带后雄原核形成率达高于有透明带（<0.05），但是无透明带组多个雄原核的比例高于有透明带组（7.04% vs 4.07%），且无透明带组卵裂率低于有透明带组（<0.05），分析透明带在精子入卵过程中起到识别和阻碍多个精子入卵的作用，无透明带时更容易发生多精入卵形成2 个雄原核，而多精入卵直接影响了受精卵的卵裂率。

表3 透明带对昆明小鼠-西门塔尔牛IVF 的影响

2.4 获得的西门塔尔牛雄原核 由图1 可知，以昆明小鼠体内成熟卵母细胞为受体进行西门塔尔牛冷冻精液IVF，可以形成西门塔尔牛雄原核。

图1 西门塔尔牛雄原核

3 讨论

IVF 技术包括动物卵母细胞的体外成熟、体外受精及胚胎的体外培养技术，学者利用该技术可以在体外环境中模拟体内的生理过程，并以此为模型获得了诸多关于动物受精过程和机理的本质性认识。1962 年，Suzuki 等成功地在新鲜的输卵管液中使兔卵母细胞体外受精，并且发育到4 细胞，这为哺乳动物IVF 技术的建立和IVF 胚胎的生产奠定了理论基础，并且在濒危动物和优良家畜品种的后代续繁、性别控制、品种资源保存等方面的应用具有重大意义。哺乳动物正常受精过程中，精子必须先穿过透明带和卵质膜才能进入卵子，而透明带和卵质膜作为受精的一个屏障，理论上只允许同种类的精子穿过，异种动物的精子无法穿过，因此异种动物卵母细胞胞质能否支持IVF 和进一步发育具有非常重要的理论和实际意义。

研究发现，地鼠卵母细胞去除透明带后，其卵膜对人、小鼠、大鼠、兔、羊、牛等哺乳类动物精子都可接受，且异种体外受精率很高，人精子可达90%以上，由此在人类医学临床上建立了精子穿透试验并作为预测男性生育能力的检测手段，说明异种动物体外受精是可行的。Zhao 等将咖啡因处理过的牛精子和无透明带或透明带完整的猪卵母细胞进行IVF，发现均能够形成雄原核或精子头部变大；Chatiza 等使用牛IVF 体系进行跳羚、黑斑羚、南非白面大羚羊附睾尾精子的精-卵互作和功能研究，发现3 种羚羊的精子都可以穿透牛卵母细胞并形成雄原核，且能够分裂到8-细胞阶段；刘玉良分别用活的大熊猫精子、精子头核和死精子注射到金黄地鼠卵中并进行电激活，受精率分别为29.63%、19.3% 和18.97%，但其没有观察后续胚胎发育的结果，与本实验结果相差无几，本实验用昆明小鼠卵母细胞作为受体，进行西门塔尔牛冷冻精子IVF，在西门塔尔牛冷冻精子的受精液和受精条件下，雄原核形成率为17.8%，卵裂率为27.27%，但是胚胎并未发育到桑椹胚阶段，结果表明种属相差较远的异种动物可以进行IVF 并形成雄原核与卵裂，但是其受精卵的后续发育比较困难，原因可能是IVF 涉及卵母细胞的体内成熟、采集和体外成熟培养、精子获能、体外受精、胚胎培养及胚胎移植等诸多环节中，构成IVF 微环境的受精液和受精温度在异种动物IVF 中起到关键作用；然而，透明带和卵质膜在动物受精过程中作为精子入卵的屏障，起到筛选和识别的作用，本实验结果显示无透明带时，雄原核形成率较高，多精入卵现象也较高，而多精入卵并不能形成合子并发育。

4 结论

本实验在模拟奶牛IVF 所需的“原生境”条件下，发现小鼠卵母细胞胞质能够支持奶牛精子形成雄原核并卵裂，研究结果可为揭示雄原核的形成机制及受精本质提供实验依据，同时也为濒危动物保护提供了潜在的解决方案。