高效色谱法测定风味发酵乳中的三氯蔗糖

林婷，刘强欣*，闻佳钰，俞婕，董叶箐，孙文闪

绿城农科检测技术有限公司（杭州 310051）

三氯蔗糖（sucralose），俗称蔗糖素，是一种高倍甜味剂，具有无能量、高甜度、安全性好等特点，是最理想的甜味剂之一，被包括中国在内的30多个国家批准作为甜味剂使用[1]。风味发酵乳除了具有丰富的蛋白质、糖类、矿物质及各种维生素外，还有抑制肠道中有害微生物生长繁殖、增进人体消化吸收的作用，因此备受消费者喜爱。添加三氯蔗糖可以调节风味发酵乳的口味，但近年来科学研究发现，三氯蔗糖会增加人们罹患白血病及其他各种癌症的风险[3-4]。我国严格限制风味发酵乳中三氯蔗糖使用量，因此风味发酵乳中三氯蔗糖的检测方法研究非常重要。

食品中三氯蔗糖的测定方法有很多[2]，主要有液相色谱串联质谱法[5-11]、离子色谱法[12-13]、高效液相色谱法[14-16]、气相色谱法[17]。液相色谱-质谱联用法虽然灵敏度高，但其设备昂贵，不利于实验室普遍推广，还有基质效应影响等；离子色谱在检测中具有对前处理要求高，易受阴离子干扰等缺点；气相色谱法前处理需进行衍生，较为繁琐；液相色谱法仪器成本低、普及率高、准确性好，因此作为首选方法。由于相关风味发酵乳中三氯蔗糖的研究相对较少，试验通过前处理条件优化，以期得到简单快速准确的测定方法，便于三氯蔗糖液相色谱法的推广使用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯，默克）；三氯蔗糖（纯度99.9%，BePure）；固相萃取柱（HLB萃取柱）；Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5.0 μm；博纳艾杰尔）；试验用水（一级水，美国Millipore超纯水仪制备）；混合微孔滤膜（0.22 μm）；风味发酵乳（市售）。

1.1.2 主要仪器与设备

高效液相色谱仪器（Shimadzu LC-20A，配有示差检测器，日本岛津公司）；电子天平（BSA224S型，德国赛多利斯）；高速冷冻离心机（ST16R，赛默飞世尔）；电热板（EH20B，莱伯泰科）；超声波清洗器（KQ5200E，昆山舒美）；涡旋振荡器（Multi-TubeVortexer型）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

标曲储备液：精确称取0.025 g（精确至0.000 1 g）三氯蔗糖至于25 mL容量瓶中，加入15 mL超纯水，溶解后，定容到刻度，其中三氯蔗糖质量浓度为1 mg/mL。置于4 ℃冰箱中保存，保存期为6个月。

标准工作液：分别准确吸0.015，0.050，0.100，0.200，0.500和1.000 mL三氯蔗糖储备液于6个10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成三氯蔗糖的系列标准溶液（0.001 5，0.005 0，0.010 0，0.020 0，0.050 0和0.100 0 g/L），现配现用。

1.2.2 样品前处理

准确称取5 g（精确至0.001 g）试样置于50 mL离心管中，加入10 mL水，涡旋混合器上涡旋3 min后加入10 mL乙腈，继续涡旋3 min，超声波提取20 min，以8 000 r/min离心3 min，将上清液转移至150 mL烧杯中。残渣中加入20 mL乙腈水溶液（50+50，V/V），涡旋3 min，以8 000 r/min离心3 min，重复提1次，合并上清液于同一烧杯中。将烧杯置于电热板上，于210 ℃蒸发至液体在10 mL左右，用30 mL水分三次冲洗烧杯，合并冲洗液置于50 mL离心管中。

将全部提取浓缩液移入已活化的固相萃取柱（HLB萃取柱，用5 mL甲醇，5 mL水活化），用5 mL水淋洗萃取柱，待柱中液体完全排出后，用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于50 ℃氮吹至近干，残渣用1 mL乙腈水溶液（20+80，V/V）溶解，过0.22 μm混合滤膜，上机测试。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流动相：乙腈-水=20∶80（V/V）；检测器采用示差检测器；进样量20 μL；流速1 mL/min。图1为三氯蔗糖标准溶液的液相色谱图。

图1 标准溶液中三氯蔗糖的液相色谱图

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取试剂的优化

风味发酵乳是指除了80%以上奶粉之外，还加入果蔬、谷物、食品添加剂等原料的发酵乳制品。三氯蔗糖具有极好的水溶性，故依据目标物质的溶解性质，该方法研究比较超纯水、甲醇水溶液和乙腈水溶液3种提取试剂，通过计算回收率比较各提取剂的提取效果。结果（图2）表明乙腈水提取试剂时提取效果（回收率）最好。原因分析可能是采用超纯水、甲醇水溶液进行提取时，提取液中会含有水溶性的蛋白质等大分子杂质，会在后续过固相萃取柱时存在堵塞萃取小柱的风险，增加目标物质的损失，且含有蛋白质的上机试样会对整个色谱系统尤其是对于液相色谱柱产生极大的不良影响。采用先加水增加液固比，加之乙腈使蛋白质变性，具有较好的沉淀效果。综合考虑，采取乙腈水作为提取试剂。

图2 不同提取溶剂对于三氯蔗糖提取效果的影响

2.1.2 提取时间的优化

该方法研究比较不同超声时间（5，10，20和30 min）对于三氯蔗糖提取效率的影响。结果（图3）显示超声时间与提取效率基本呈正相关关系，在20 min时可以获得较好的回收率，而继续增加超声时间提取效率并无明显增加，故选择提取时间为20 min。

图3 不同提取时间对于三氯蔗糖提取效果的影响

2.1.3 提取液浓缩方式的优化

由于提取液中有机相约占50%，比例较高，提取液直接过固相萃取柱不利于净化柱对目标物质（三氯蔗糖）的吸附，则需要通过提取液浓缩的方式将有机相比例降低。试验方法比较50 ℃氮吹仪吹干、210 ℃电热板烤干和沸水浴蒸发皿蒸干3种浓缩方法。现有氮吹仪的单次使用最大限值为10 mL，样品提取液需进行多次氮吹，而且提取液中水分几乎占到一半，提取液不易吹干，耗时较长；沸水浴蒸发皿蒸干容易爆沸，不利于大批量样品同时处理；用210 ℃电热板烤干，10余个试液可以同时进行，可以节约时间，提高工作效率，因此选择210 ℃电热板烤干进行提取液的浓缩。

2.1.4 固相萃取柱的优化

风味发酵乳主要含有奶粉、果蔬、谷物、食品添加剂等原料物质，这些杂质的存在会干扰化合物的测定，影响方法的灵敏度、精密度和准确度。因此选择合适的淋洗液来除去杂质以降低杂质对于结果的干扰作用尤为重要。研究超纯水、5%甲醇水、10%甲醇水、20%甲醇水作为淋洗液处理试样。结果（图4）表明三氯蔗糖含量随着淋洗液有机相比例的提高而降低，超纯水净化效果最佳，其他3种淋洗液回收率偏低，可能由于淋洗液中甲醇会将萃取柱中目标物质洗脱，甲醇含量越高造成目标物质损失越大，使得目标物质回收率偏低。故选择超纯水作为淋洗液。

图4 不同淋洗液对于三氯蔗糖提取效果的影响

选择合适的溶剂将吸附在固相萃取柱填料上的目标物洗脱也是十分重要的一环，研究甲醇、80%甲醇水、50%甲醇水、20%甲醇水作为洗脱液处理试样。结果（图5）表明三氯蔗糖含量随着洗脱液有机相比例的升高而提高，甲醇的洗脱效果最佳，其他3种洗脱液洗脱效果较差，故选择甲醇作为洗脱液。

图5 不同洗脱液对于三氯蔗糖提取效果的影响

2.2 方法的线性范围及检出限

方法的检出限（LOD）的确定参考GB 22255—2014《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》[18]，通过空白样品不断降低三氯蔗糖标准溶液的添加浓度，当在仪器上色谱峰达到3倍信噪比（S/N）时对应的加标浓度即为检出限，定量限（LOQ）的确定参考GB 22255—2014通过空白样品不断降低标准溶液的添加浓度，当在仪器上色谱峰达到10倍信噪比（S/N）时对应的添加浓度即为定量限。以浓度和峰面积建立标准曲线，得到对应的线性方程及相关系数，在一定浓度范围内，浓度与峰面积呈正比例关系，线性关系良好（见表1）。

表1 三氯蔗糖的线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.3 回收率及精密度试验

对不含三氯蔗糖的风味发酵乳在0.003，0.015和0.300 g/kg（定量限、5倍定量限和限量值）3个水平下进行添加回收试验，按照1.2.2方法处理后进行测定6次，计算添加回收率（见表2）

从表2可以得出，该测定方法下三氯蔗糖的回收率满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[19]要求（90%～110%），且相对标准偏差低于5%，由此可以看出测定结果稳定。

表2 回收率及相对标准偏差（n=6）

2.4 实际样品测试

运用试验方法对购自超市的5份风味发酵乳进行测定分析，每个样品重复测定2次。结果表明5个样本中1份样品含有三氯蔗糖，检出情况见表3（其中样品色谱图见图6，空白样品色谱图见图7）。根据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品营添加剂使用标准》[20]中风味发酵乳中三氯蔗糖使用限量，所检出的阳性样品低于0.300 g/kg，符合国家标准要求。

表3 样品中三氯蔗糖的测定

图6 风味发酵乳中三氯蔗糖的液相色谱图

图7 空白样品中三氯蔗糖的液相色谱图

3 结论

试验建立固相萃取柱净化-液相色谱示差检测器测定风味发酵乳中三氯蔗糖含量检测方法，重点研究提取试剂、提取时间、提取液的浓缩方法、固相萃取柱溶剂4个方面，试验结果表明，前处理提取净化效果对检测结果准确性有很大的影响，固相萃取柱可有效消除风味发酵乳中杂质对目标物的干扰。该方法测定结果准确、稳定、可靠，三氯蔗糖在0.001 5～0.100 0 g/mL之间线性关系良好，平均回收率为90.3%～96.7%，方法定量限为0.003 g/kg，优于GB 22255—2014[18]中规定的0.007 5 g/kg。该方法更加便于在日常工作中的推广，为风味发酵乳中三氯蔗糖的测定提供重要参考。方法不足之处在于使用测定的检测器为液相示差检测器，然而示差检测器对环境温度有着极高的要求，且无法进行梯度洗脱。