液质联用法筛查药食同源中药中多种真菌毒素

刘瑜*，于丽，姜玲玲，耿庆华，肖珊珊，姚佳

1.沈阳海关技术中心（沈阳 110016）；2.大连海关技术中心（沈阳 116000）；3.锦州海关技术中心（沈阳 121000）

肉豆蔻、金银花、枸杞子等药食同源性中药材日常多用于保健、药用。近年来药食同源性中药材在重视疗效的同时，其安全性也受到广泛关注。由于中药材在种植、采收、加工、运输和储藏等过程中，都有可能污染产毒真菌而导致真菌毒素残留，进而影响中药及其产品的质量和安全性，严重威胁消费者的身体健康和生命安全。真菌毒素的毒性包括肝毒性、肾毒性、神经毒和震颤毒等，某些真菌毒素具有强致癌性，严重威胁人类的身体健康，甚至生命安全。中药材种类繁多，霉变情况各异，真菌毒素的污染和残留水平及对药材质量的影响也差异较大[1-2]。

随着对真菌毒素风险认识的不断深入，许多国家都对真菌毒素的残留量进行强制性规定。GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定多种真菌毒素的限量要求。真菌毒素污染引起的中药材霉变是影响中药材及其制品使用安全及质量的主要问题之一。真菌毒素检测方法的建立及污染的研究多在谷类、农产品等食品领域[3-7]，在中药材中研究较少，国家、行业标准也都是针对粮谷、饲料等基质，仅2020年版中国药典中对部分真菌毒素如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素、伏马毒素等每种毒素采用单独的检测方法进行测定。试验通过建立多种真菌毒素的筛查、检测方法，从而使食同源性中药材中真菌毒素得到有效控制。

真菌毒素的定量检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC）[8-11]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[12-16]等。这些传统检测方法普遍存在定性干扰大，定量灵敏度不足，且只能1次实现1种或1类真菌毒素的定性和定量分析，无法满足实际样品中多种痕量真菌毒素污染物同时检测的需求。液相色谱-串联质谱法与高效液相色谱法相比，定性更加准确，但两者都是针对目标化合物的检测，需要同时与标准溶液进行对照，并且仍然会出现假阳性样品的检出，无法实现化合物的确证和未知峰的筛查。试验利用三重四极杆-串联线性离子肼质谱的谱库检索功能，建立药食同源性中药材中13种真菌毒素的筛查、检测方法，可实现一次进样分析筛查、确证、定量同时完成，对于新方法开发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲酸（优级纯，美国Dikma公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Merk公司）；无水硫酸镁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷键合硅胶（美国迪马公司）；HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL，上海安谱公司）。

标准品：伏马毒素B1、伏马毒素B2、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、T-2毒素、柄曲霉素、霉酚酸、黄绿青霉素、青霉震颤素A（均为100 μg/mL，天津阿尔塔）。

肉豆蔻、金银花、枸杞子、山楂、菊花等中药材（均购自药房）。

1.2 仪器与设备

LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB Sciex QTrap 6500四极杆串联离子阱质谱仪（美国AB公司）；BSA220电子分析天平（感量0.01 g，德国赛多利斯公司）；SR-1强力振荡器（日本Taitec公司）；EVA50样品浓缩仪（普利泰科公司）；Z323K高速离心机（HERMLE公司）；XW-80A混匀器（上海沪西分析仪器有限公司）；Millipore纯水机（美国Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取2 g（精确到0.01 g）样品，置于10 mL离心管中，加入10 mL冷冻后的乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）溶液，振荡提取10 min，加入3.0 g无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（4∶1，W/W），振荡器上振荡3 min，按8 000 r/min离心10 min，取上清液至预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺150 mg，十八烷基硅烷键合硅胶150 mg）中，涡旋混匀，振荡5 min，按8 000 r/min离心5 min，精确取5 mL上清液氮吹浓缩至近干，加入乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）溶液定容至1.0 mL，样液过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.2 色谱条件

色谱柱Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；进样体积10 μL；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；流动相A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈。梯度洗脱程序：0 min，40% A；1 min，40% A；8 min，0% A；10 min，0% A；10.1 min，40% A；12 min，40% A。

1.3.3 质谱条件

离子源ESI+，电喷雾电压（IS）5 500 V；雾化气压力（GS1）50 psi；气帘气压力（CUR）25 psi；辅助加热气压力（GS2）60 psi；离子源温度（TEM）550 ℃；入口电压（EP）10 V；碰撞室出口电压（CXP）15 V；检测模式MRM-IDA-EPI。所测定的13种真菌毒素的保留时间及质谱参数见表1，13种真菌毒素的总离子流图见图1。

表1 13种真菌毒素的质谱参数

图1 13种真菌毒素的色谱图

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

2.1.1 提取溶剂的选择

比较乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-甲醇-水溶液3种溶剂的提取效率，结果表明绝大多数化合物在乙腈中比在甲醇中提取回收率高，只有T-2毒素在甲醇中响应值高，因此选择乙腈-甲醇-水溶液作为提取溶剂，在提取溶剂中加入1%甲酸，增加大多数化合物的提取效率，故最终选定的提取溶剂为乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）。不同提取溶剂各化合物回收率见表2。

2.1.2 净化方式的选择

比较QuEChERS、HLB固相萃取柱、不净化直接提取法3种不同方式净化效果，通过对13种真菌毒素回收率的测定来确定样品净化的最佳条件。结果表明，净化后检测本底低，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、青霉震颤素A回收率均有显著提高，QuEChERS和HLB固相萃取柱相比，HLB固相萃取柱净化后检测本底更低，但经QuEChERS净化后各化合物回收率均高于经HLB固相萃取柱净化。因此最终选择QuEChERS的净化方式。不同净化方式各化合物回收率见表2。

表2 各化合物不同前处理方法回收率 单位：%

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化

分别采用乙腈-水、甲醇-水的流动相体系，考察各化合物的色谱行为，发现乙腈-水作流动相各化合物响应值都大于甲醇-水作流动相，因此选择乙腈-水作为流动相，在流动相中加入0.1%甲酸，可以增加各化合物的离子化效率，提高检测灵敏度，故确定流动相体系组成为乙腈-0.1%甲酸水溶液。

2.2.2 质谱条件的优化

将0.5 μg/mL的标准溶液通过针泵进样方式，找到各化合物的母离子、子离子，优化DP、CE等质谱参数，建立MRM方法；切换到EPI模式，在不同碰撞能量下，采集各化合物的二极全扫描质谱图；添加IDA，建立MRM-IDA-EPI方法。

2.3 方法的线性范围及检出限

采用基质匹配标准曲线的定量方法，以消除基质效应的影响。用空白基质溶液配制浓度分别为0.05，0.2，0.5，2.0，5.0和20 ng/mL的13种真菌毒素混合标准溶液，以峰面积比为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，13种真菌毒素在0.05～20 ng/mL范围内均呈现良好线性关系，相关系数（r）均大于0.993，见表3。依据信噪比S/N=3计算方法的检出限，13种真菌毒素的检出限为0.1～10 μg/kg，见表3。

2.4 回收率及精密度试验

向金银花空白样品中分别添加13种真菌毒素的混合标准溶液，制成模拟加标样品，添加浓度水平分别为1.0，2.0和10 μg/kg。每个浓度水平平行测定6次，按照上述方法测定，计算各物质的平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。结果表明，金银花样品中13种真菌毒素平均回收率为66.3%～91.8%，相对标准偏差为2.8%～7.7%，见表3。

表3 方法学验证数据

2.5 实际样品检测

应用上述试验方法，对市售的肉豆蔻、金银花、枸杞子、山楂、菊花等20余批次样品进行检测，其中在1批肉豆蔻中检测黄曲霉毒素B1。

3 结论

采用乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）溶液提取，QuEChERS净化，LC-MS/MS检测方法建立药食同源性中药材中13种真菌毒素的定性、定量分析方法。在四极杆质谱MRM基础上，结合离子阱质谱特有的EPI扫描模式，得到化合物的二极全扫描质谱图，对于色谱图中的未知可疑峰可直接关联到质谱谱库检索、比对功能，通过比对二极质谱图，实现对色谱图中未知峰的筛查及可疑峰的确证。该方法应用于实验室日常检测，可极大提高检测结果的准确性和检测效率，对于发现样品中未知组分提供新思路。