一株百合内生细菌Burkholderia sp. FJb-2的分离鉴定及其体外抑菌促生效应

孙雨晨，易欣欣，王丽伟，程兆伦，张秀海*，高俊莲*

（1.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；2.北京市农林科学院，北京农业生物技术研究中心，北京 100097；3.蒙阴县住房和城乡建设局，山东 蒙阴 276200）

百合是单子叶植物纲百合科（Liliaceac）百合属（Lilium）多年生草本植物，是目前著名的观赏花卉之一［1］。百合具有很高的观赏价值，同时还具有较高的食用和药用价值［2］。然而，百合是一种较易感病的花卉，随着栽培面积的不断扩大，病害发生已日趋严重，已成为制约百合产业发展中的主要因素之一［3-5］。百合主要病害包括百合枯萎病，也称百合根腐病、茎腐病，是百合生产中严重的土传病害［6］；百合灰霉病，又称叶枯病，主要危害百合的叶、茎和花，导致叶片枯死、花器褐腐、茎秆发黑和鳞茎停止生长，严重影响切花及种球的产量和质量［7］；百合叶尖干枯病，是常发生在百合生长初期的叶部主要病害，主要危害叶尖，叶尖发病后变为黑褐色坏死或干枯，并不断向叶基部扩展［8］。目前百合病害的防治主要采用化学防治，但是长期使用化学农药，不仅会造成环境污染、破坏生态平衡，而且农药残留使食用和药用百合品质降低，存在很大食品安全的隐患；同时会使病原菌产生抗药性，影响防治效果。生物防治作为一种新的防治策略，对环境友好、无抗药性、防效持久，拥有良好的应用前景。此外，与其他农作物一样，百合生产中同样存在着化肥、农药等农用化学投入品过量使用而引起的一系列环境污染问题。如何在病害严重、减肥、减药及干旱等不良气候条件下提高百合产量，已成为百合产业面临的严峻挑战。

植物内生菌（Endophyte）是指在健康植物体内寄生，在各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期，而不致使寄主植物表现任何病害症状的一类微生物，主要包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌3类［9］。内生细菌被认为是根际细菌的一个分支，通常也称为植物根际促生细菌（PGPR）［10］。实际上，内生细菌具有植物根际细菌的促进植物生长所有重要特性，并且内生细菌对宿主植物提供的有益作用通常大于根际细菌［11］。尤其当植物受到逆境胁迫挑战时，这种有益作用可能会更大［12-13］。目前己从大豆、玉米、棉花、小麦、水稻、马铃薯等多种作物中分离获得具有促生或者生防作用的内生细菌［14-15］，但是关于百合内生细菌的研究报道较少，本课题组最近两年陆续报道了从百合鳞茎球中分离获得了几株具有拮抗病原菌和促进百合生长的芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的内生细菌［16-17］。红芯百合（Fangio），为亚洲百合与铁炮百合的杂交品种，抗病性较强，切花商品价值较高［18］。本研究以百合抗病品种—红芯百合植株样品为研究对象，分离筛选兼具拮抗与促生特性的百合内生细菌，为研发百合环境友好型抗病促生长微生物菌剂提供优良菌种资源和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试植物

供试红芯百合（Fangio）为荷兰进口，种植于北京市农林科学院生物技术研究中心房山百合资源圃。

1.1.2 百合病原真菌

百合灰霉病菌—灰葡萄孢（Botrytis cinerea）ACCC 36423和百合叶尖干枯病菌—葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）ACCC 37263均购自中国农业科学院农业微生物菌种保藏中心；百合枯萎病菌—尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）F01 139由中国农业大学植物病理学系罗来鑫老师惠赠。

1.1.3 培养基

本实验使用的培养基有LB培养基［19］、PDA培养基［20］、DF培养基［21］、ADF培养基［将1-氨基环内烷-1-羧酸（ACC）溶于超纯水，过滤灭菌，加到不含（NH4）2SO4的灭菌DF培养基中，终浓度为3.0mmol/L］、无机磷培养基［22］、CAS培养基［23］。

1.2 实验方法

1.2.1 内生细菌的分离

采用的组织块方法［24］分离百合内生细菌：将采集到的健康百合植株样品，用自来水冲洗掉表面残留的泥土等杂质。将植株根、茎、叶分开，并将茎部剪成10 cm左右的小段，然后对分离部位进行表面消毒：用75%乙醇浸泡分离部位10 min，之后用2.5% NaClO溶液浸泡3 min，然后再用无菌水冲洗3遍，用灭菌滤纸吸干百合植株样品的水分，用灭菌的剪刀将其剪切成5 mm左右大小的片段，置于LB平板培养基上，每个平板上夹取8～10段，放入28℃恒温培养箱中培养2～3 d，观察LB平板内生菌的生长情况，待植物组织材料切口处长出菌落，及时转接于新鲜LB平板进行纯化，纯化后的菌种加入30%甘油，于-80℃超低温冰箱保藏。

1.2.2 拮抗百合病原真菌活性的测定

采用平板对峙法，筛选具有拮抗百合病原真菌活性的内生细菌。参考Khan等［17］的实验方法，将植物病原真菌接种于PDA培养基平板上，28℃下，培养一周后，采用灭菌的1 mL微量移液器蓝色枪头尾部圆孔取直径7 mm的含有真菌的琼脂圆盘，转移到新鲜PDA培养基平板的中心。将细菌菌株活化于LB液体培养基中，200 r/min，28℃，培养2 d。然后将PDA平板平均分成4个区域，在每个区域内距中心约2.5 cm处接种约10 μL已经在LB液体培养基中培养了2 d的细菌菌液，将平板在28℃培养箱培养5～7 d。以没有接种细菌的真菌平板作为对照，定期检查平板的病原真菌和细菌菌株的生长情况，待对照PDA平板上的真菌菌丝体到达平板的边缘后，并测量对照真菌与抑制真菌生长的直径。使用以下公式计算病原真菌的生长抑制率［17］：生长抑制率（%）=（C-T）/C×100，其中C是对照组PDA板上的真菌菌丝体生长区域的半径（mm），T是接种有细菌（实验组）的真菌菌丝体生长区域的半径（mm）。每个处理重复3次。

1.2.3 植物促生长特性分析

（1）ACC脱氨酶阳性菌株筛选及活性测定。阳性菌株筛选：将菌株FJb-2接入5 mL LB液体培养基中，28℃培养24 h进行活化后，吸取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，离心（8000 r/min，4℃）10min收集菌体。弃上清，用1 mL无菌水重悬菌体。吸取100 μL菌悬液于2 mL ADF培养基中，28℃，200 r/min培养48 h，观察结果，若培养液变浑浊，则该菌株可利用ACC为氮源而生长，初步表明其有产ACC脱氨酶活性。

ACC脱氨酶活性测定：参考Penrose等［21］和陈坚等［25］的实验方法。

（2）菌株产生长素能力测定：采用Salkowski等［26］的比色法测定内生细菌产生长素（IAA）能力，将菌株FJb-2接入5 mL LB液体培养基中，28℃培养24 h进行活化，转接于含3 mmol色氨酸的5 mL LB液体培养基中，28℃，200 r/min摇床培养24 h。取1 mL菌悬液4000 r/min，4℃，离心10 min，取上清液与 Salkowski比色液（50 mL 35%HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3）等体积混合，阴性对照是LB培养基和Salkowski比色液等体积混合，阳性对照为100 mg/L的IAA溶液和Salkowski比色液等体积混合，避光静置30 min，观察颜色变化，颜色变红者表示产生了IAA。对颜色变红的阳性菌株，进一步测定其OD 530 nm值。阴性对照是单独的LB培养基和Salkowski比色液混合。用分析纯IAA标准品绘制标准曲线，IAA浓度依次为0、10、20、40、60、80、100 mg/L。以吸光度值为纵坐标，IAA浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算菌液中IAA的浓度。实验设置3次重复。

（3）菌株溶磷能力的测定：用LB液体培养基活化FJb-2菌株，培养24 h后，将其点接种于无机磷培养基上，接种量为10 μL，每个处理重复3次，28℃培养7 d，观察解磷圈，出现透明圈，表示该菌株将难溶的磷转化为可溶性憐，记为有解磷活性，测量解磷圈直径（D）与菌落直径（d），并计算D/d值，初步判定其解磷能力的大小。

（4）菌株产铁载体能力的测定：在CAS培养基上，对菌株FJb-2进行产铁载体能力的测定。将细菌菌株接种于LB液体培养基，200 r/min，28℃，培养2 d。取10 μL的细菌培养液点接在CAS定性蓝色检测平板，每个菌设3个重复，28℃下培养5 d。在CAS检测平板上，分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橙色铁载体晕圈。记录平板上橙色晕圈的有无，并测定单菌落橙色铁载体晕圈直径和菌落直径的比值。

1.2.4 内生细菌的鉴定

（1）形态学观察：将菌株FJb-2活化接种于LB培养基平板上，28℃培养1 d，挑取菌落置于1mL无菌水中重悬，制备成菌悬液。然后以此稀释获得不同的稀释度，取10-3、10-4、10-5和10-6的稀释液涂布在LB培养基上，倒置于28℃的培养箱中培养3 d，观察其菌落形态特征。挑选LB培养基上的菌落，使用BIOMÉRIEUXTM革兰染色液试剂盒进行革兰氏染色，用普通光学显微镜观察染色结果。进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态特征，再使用扫描电镜观察菌体结构。

（2）分子生物学鉴定：采用天根细菌基因组DNA试剂盒提取FJb-2菌株的基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书标准流程进行。以基因组DNA为模板，用细菌的16S rRNA通用引物对细菌基因组DNA进行PCR扩增［27］。引物分别为：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）采 用25 μL体系进行扩增，扩增体系为：Premix TaqTM12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，模板1μL。PCR扩增程序为：94℃ 3 min，94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环，72℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测获得目的条带（1500 bp左右），扩增样品送至北京博迈德测序公司进行测序，将得到的16S rRNA 序列在EzBioCloud数 据 库（http：//www.ezbiocloud.net/）［28］中 的 相应基因序列进行同源性比较，利用MEGA 7.0［29］进行Clustal W多重序列比对，并采用Kimura 2-parameter模式和Neighbor-joining算法构建系统发育树，并将该序列提交至GenBank数据库获取基因登录号。

2 结果与分析

2.1 百合内生菌分离及其对百合病原真菌的拮抗特性

本研究从百合Fangio植株体内分离获得16株内生细菌，将16株内生细菌纯化培养，对其进行产1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶活性、产生长素（IAA）、溶磷、产铁载体等多种植物促生特性初筛，发现菌株FJb-2同时具有以上4种功能特性，故进一步对该菌株的抑菌活性进行了测定。菌株FJb-2分别与百合病原菌Botrytis cinerea（ACCC 36423）、Botryosphaeria dothidea（ACCC 37263）和Fusarium oxysporum（F01139）进行对峙培养，结果表明：菌株FJb-2对测试的百合病原真菌菌丝生长具有较好的生长抑制作用（图1）。该菌株对测试百合病原真菌的生长抑制率为（60.00%±3.14%）～（81.88%±1.25%）。其中对百合灰霉病菌—灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）ACCC 36423的抑制作用最强，抑制率高达81.88%±1.25%；对百合叶尖干枯病菌—葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）ACCC37263和百合枯萎病菌—尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）F01139的抑菌率分别为72.78%±2.8%和60.00%±3.14%。

图1 菌株FJb-2对百合病原真菌的抑制作用

2.2 菌株FJb-2植物促生长特性的分析

为了评价菌株FJb-2促进植物生长的潜力，分别进行该菌株产生ACC脱氨酶、产生IAA、产生铁载体、溶磷等促生长特性的定性或定量分析，结果表明，内生细菌菌株FJb-2在所有测定中均显示阳性结果。

2.2.1 菌株FJb-2产ACC脱氨酶活性的测定结果

菌株FJb-2在以ACC为唯一氮源的培养基中生长良好（图2A），可以初步判定菌株FJb-2有产ACC脱氨酶的能力。对菌株FJb-2的ACC酶活性定量测定后，发现该菌株所产的ACC脱氨酶的活性为（35.28±0.05）μmol α-酮丁酸/（mg·h）。当细菌菌株ACC脱氨酶活性高于20 nmol α-丁酮酸/（mg·h）蛋白时，即可表现出明显的植物促生长作用［21］。该菌株产ACC脱氨酶能力较强，预示其具有较强的植物促生长潜力。

图2 菌株FJb-2植物促生长的特性定性测定

2.2.2 菌株FJb-2产IAA的能力

通过定性和定量测定均检测到菌株FJb-2具有一定产IAA的能力。在定性测定的实验中，菌株FJb-2培养液的颜色位于阴性对照（无色）和阳性对照（粉红色）之间（图2B），这表明菌株FJb-2具有产IAA的能力；在定性测定的基础上，通过比色法进行定量测定，发现该菌株产生的IAA浓度可以达到（11.22±0.27）mg/L。

2.2.3 菌株FJb-2溶磷能力的测定结果

具有溶磷能力的菌株具体表现为在菌落周围形成透明的溶磷圈。菌株FJb-2在无机磷培养基的检测板上，出现明显的溶磷透明圈（图2C）。通过溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）的比值确定溶磷能力大小，比值越大溶磷能力越强，D/d值在1.0～2.0属于中等溶磷能力菌株，D/d值≥2.0属于强溶磷能力菌株［30］。菌株FJb-2的D/d值为2.2，这说明菌株FJb-2具有强溶磷能力。

2.2.4 菌株FJb-2产铁载体能力的测定结果

采用CAS蓝色定性检测固体培养基对菌株进行产铁载体能力的定性测定，发现菌株FJb-2能在CAS蓝色定性检测固体培养基上形成橙色晕圈（图2D）（嗜铁圈），其可溶性指数为1.92，表明该菌株具有非常明显的产铁载体能力。

2.3 菌株FJb-2的初步鉴定

2.3.1 FJb-2菌株形态特征观察

菌株FJb-2接种于LB平板上培养3 d后，菌落呈圆形，边缘整齐，呈污白色、有光泽，菌落直径约为1～2 mm（图3A）。通过光学显微镜观察发现菌体呈短杆状，革兰氏染色呈阴性（图3B）；采用扫描电子显微镜，观察细胞的形态，并测量细胞的大小，菌落FJb-2的细胞形态为杆状，菌体大小为（0.29～0.57）μm×（0.71～2.41）μm（图3C）。

图3 菌株FJb-2的菌落形态、革兰氏染色和菌体形态图

2.3.2 FJb-2菌株的16S rRNA序列分析结果与系统发育分析

FJb-2菌株的16S rRNA基因序列的PCR扩增产物，经琼脂糖凝胶（1%）电泳检测，在1500bp附近有目的条带，送交至测序公司进行测序。将FJb-2测序所得的16S rRNA基因序列提交至GenBank数据库，获得登录号为MW541881。

通过邻接法（NJ）对菌株 FJb-2的16S rRNA基因序列，在EzBioCloud数据库找到同源性较高的相关序列进行系统发育分析，并构建进化树（图4）。分析结果表明，菌株FJb-2与菌株Burkholderia gladioli（NBRC 13700）的亲缘关系最近，两者序列相似性达到99.63%。通过构建的系统进化树（图4）也可以看出，菌株FJb-2在进化树上与菌株Burkholderia gladioli聚于同一系统发育分支，表明该菌株属于Burkholderia属。

图4 基于16S rRNA基因序列建立的菌株FJb-2的系统发育树

3 讨论与结论

百合生产及储运过程中病害频发已成为制约百合产业健康发展的瓶颈，生物防治对环境友好，且无农药残留，也无抗药性，拥有良好的应用前景。植物内生菌是一类天然的生防菌资源，文献报道植物内生菌在多种植物病害防治中具有明显的效果。本研究中从百合植株的茎部分离获得1株内生细菌Burkholderiasp. FJb-2，该菌株同时对测试的几种主要百合病害病原菌，包括百合枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、百合灰霉病菌（Botrytis cinerea）和百合叶尖干枯病菌（Botryosphaeria dothidea）均有较高的拮抗活性，对病原真菌的生长抑制率范围为60%～81%。因此，该菌株在百合病害生防菌剂研发中具有较好的应用潜力，可以成为优良候选菌株。

大多数植物内生菌与根际细菌等植物相关细菌都具有直接或间接促进植物生长和发育的功能，其促进植物生长的机制有多种，比如通过溶磷、固氮作用为植物提供养分，产生植物激素，影响植物对水和矿物质的吸收，促进植物根系发育而直接促进植物生长；或者间接地通过减少各种病原体对植物生长发育的抑制作用而促进植物生长等［31］。植物内生菌与根际细菌的研究与应用为农业生产减少化肥与农药的使用提供了一条有效途径，对可持续农业的发展具有重要意义。

具有溶磷特性的菌株FJb-2有为植物提供磷素的潜力，同时菌株FJb-2有一定产生IAA的能力，暗示着其具有促进植物生长的潜力。铁载体是由细菌、放线菌、真菌、某些藻类和植物在低铁胁迫下合成的低分子量铁离子特异性螯合剂，铁载体的主要作用是促进铁元素的吸收［32］。据报道，产铁载体植物根际促生细菌在促进植物生长发育、增加作物产量、提高植物的抗逆性以及抑制根际有害菌群等方面也发挥着重要的作用［32-33］。菌株FJb-2具有较强的产生铁载体的能力，预示着其在促植物生长及活化铁元素方面具有巨大潜力。多种根际细菌合成的ACC脱氨酶减少了植物中有害乙烯的含量，并平衡了脱落酸ABA水平［34］。ACC脱氨酶将ACC降解为α-酮丁酸和氨，为植物提供氮和能量，因此降低植物体内乙烯含量水平［35］。已经证明产ACC脱氨酶的植物根际促生细菌可以赋予植物对干旱胁迫、盐分胁迫、洪涝等许多环境胁迫的耐受性［19］。干旱也是严重制约百合产业发展的因素之一［36］，菌株FJb-2具有较高的ACC脱 氨 酶 活 性［（35.28±0.05）μmol α-酮 丁 酸/（mg·h）］，可能在提高百合抗旱性能方面有很好的应用潜力。

伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）是一类重要的生防菌，其在农业领域中具有生物防治及促进植物生长等多种生物学功能［37-38］。本研究通过16S rRNA基因序列分析将菌株FJb-2初步鉴定为伯克霍尔德氏菌属细菌。据我们所知，这是首次报道从百合体内分离获得伯克霍尔德氏菌属内生细菌，该菌株不但具有拮抗多种百合病原真菌的能力，而且还具有多种植物促生特性，且具有较大的百合微生物肥料和生物农药开发应用潜力。

本研究从红芯百合植株茎部中分离到1株具有明显抑制多种百合病原真菌活性的细菌FJb-2。通过百合病原真菌拮抗实验观察到菌株FJb-2对百合灰霉病菌—灰葡萄孢菌、百合叶尖干枯病菌—葡萄座腔菌和百合枯萎病菌—尖孢镰刀菌均有较高的拮抗活性，对病原真菌的生长抑制率范围为60%～81%。这说明菌株FJb-2是一株很有潜力的植物促生内生菌，同时表明该菌株可能通过几种机制共同起作用来发挥其促生作用。而该菌株的生防、促生、抗旱等潜力有待于进一步的田间试验证实。