UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法分析桃红四物汤物质基准中化学成分

李浩然， 王少平， 孙志强， 董萍萍， 柏道明， 高 鹏， 刘永俊， 代 龙*，张加余*

(1.滨州医学院药学院，山东 烟台 264003；2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250300；3.山东禹泽药康产业技术研究院有限公司，山东 德州 251200；4.山东祥隆医药研究院有限公司，山东 烟台 264003)

桃红四物汤又名加味四物汤，是由桃仁、红花、熟地、当归、芍药、川芎构成的的活血补气之要方，最早记载于《医宗金鉴》[1]，中医临床将该方用于血虚兼血瘀证及经期超前、血多有块、色紫稠粘、腹痛等妇科疾病的治疗[2-3]。桃红四物汤物质基准是在提取方式遵循古法的前提下，将煎液冷冻干燥后所得，但目前关于其质量方面的报道较少，大多为临床应用与成分定量研究[4-5]，更缺少全成分表征研究[6]。

超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，可用于中药复方化学成分的系统分析[7-9]。本实验采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法对桃红四物汤物质基准中化学成分进行分析，以期为该方药效物质基础、质量控制、现代制剂开发提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 UHPLC-Q Exactive-Orbitrap高分辨质谱，配置电喷雾离子源、XCalibur 2.1质谱工作站(美国Thermo Scientific公司)；AB204-N电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；BT25S电子天平(德国Sartorius公司)；MB-1-2封闭式调温加热器(北京科伟永兴仪器有限公司)；BIL-500C超声波清洗仪(上海比朗仪器制造有限公司)；LGJ-10C冷冻干燥机(北京四环福瑞科学仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 芍药内酯苷(批号S-011-160304)对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司；羟基红花黄色素A(批号111637-201810)、毛蕊花糖苷(批号111530-201713)、山柰酚(批号110861-202013)、阿魏酸(批号110773-201614)对照品均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%。色谱纯甲酸、乙腈、甲醇购自天津康科德科技有限公司；水纯净水(杭州娃哈哈饮用水有限公司)。

1.2 药材 白芍、熟地、红花、桃仁、当归、川芎均由安徽亿帆医药股份有限公司提供，经济南市食品药品检验所宋希贵研究员鉴定为正品，均符合2015年版《中国药典》规定。

2 方法

2.1 物质基准制备 通过剂量考证，分别称取酒地黄11.19 g、酒当归14.92 g、白芍5.60 g、川芎3.73 g、桃仁3.78 g、红花3.73 g，其中酒地黄制法为取生地黄适量，加入黄酒，蒸法蒸至黑润，取出，晒至八成干，切厚片或块，干燥；酒当归制法为取当归净片适量，加黄酒拌匀，闷透，置炒制容器内，用文火炒干；其余药味均依照2015年版《中国药典》方法炮制。桃仁研泥，与地黄、当归、白芍、川芎、红花一同置砂锅内浸泡30 min，第1次加9倍量水(385 mL)，用电陶炉作为热源，先武火(600 W)加热至沸，后文火(150～200 W)保持微沸30 min，第2次加7倍量水(300 mL)煎煮20 min，150目尼龙滤布过滤，煎液减压浓缩至相对密度为1.11(40 ℃)，冷冻干燥，粉碎，混匀，分装，即得。

2.2 溶液制备

2.2.1 全方供试品溶液 取物质基准0.034 g，置于10 mL量瓶中，加8 mL水超声提取，加水至刻度，滤过，即得。

2.2.2 各单味药供试品溶液 按照处方比例称取各单味药适量，按“2.1”项下方法制备冻干粉，分别取0.028 g，置于10 mL量瓶中，加8 mL水超声提取，加水至刻度，滤过，即得。2.2.3 对照品溶液 精密称取芍药内酯苷、阿魏酸、山柰酚、羟基红花黄色素A、毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为15.9、9.83、10.14、12.5 μg/mL的溶液，即得。

2.3 色谱条件 Waters ACQUITYTMC18色谱柱(150 mm× 2.1 mm，1.7 μm)；流动相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～1 min，95% A；1～35 min，95%～5% A；35～37 min，5%～95% A；37～40 min，95% A)；柱温30 ℃；体积流量0.3 mL/min；进样量1 μL。

2.4 质谱条件 正负离子扫描模式；鞘气、辅助气氮气(纯度≥99.99%)，体积流量30、10 L/min；毛细管温度320 ℃；蒸发器温度400 ℃；喷涂电压为4 500～3 800 V；分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；扫描范围m/z80～1 200；碰撞能30 eV。

3 结果

3.1 化学成分鉴定 采用Thermo Xcalibur 2.1工作站进行数据采集和处理，通过文献比对、数据库搜索、对照品比对、高分辨质谱数据分析共鉴定出了48种成分，包括10种有机酸、12种萜类、3种鞣质、4种黄酮、2种苯乙醇苷、17种其他类，总离子流图见图1，具体信息见表1。

表1 物质基准鉴定结果

图1 物质基准在正(A)、负(B)离子模式下总离子流图

3.2 有机酸 包括5-O-咖啡酰奎尼酸(4)、对羟基苯甲酸(5)、3-O-咖啡酰奎尼酸(8)、1-O-咖啡酰奎尼酸(10)、4-O-咖啡酰奎尼酸(14)、对香豆酸(17)等，在负离子模式下由于脱羧基易产生相差44(CO2)的碎片离子，因此其准分子离子峰不易被检测，并且因咖啡酰基断裂，易产生m/z179、191的特征碎片离子。以5-O-咖啡酰奎尼酸(4)为例，其负离子模式二级质谱图见图2A，准分子离子m/z353.087 04，保留时间3.96 min，分子式C16H18O9；其二级质谱中m/z179由分子离子于b位断裂产生的咖啡酰基碎片离子，碎片离子m/z135比m/z179少44，是由后者中性丢失一分子CO2得到；离子m/z191为a位酰基断裂产生的奎尼酸碎片离子，与文献[14]报道一致，并通过比对组方与红花二级质谱图(图2B)鉴定为5-O-咖啡酰奎尼酸，主要由红花提供。另外，其余简单有机酸类成分，如对羟基苯甲酸(5)、对香豆酸(17)、苯甲酸(20)的二级质谱中也可观察到[M-H-CO2]-或[M+H-CO2]+的特征碎片离子。

图2 M4于桃红四物汤(A)、红花(B)中的二级质谱图

3.3 黄酮 裂解途径见图3。

11准分子离子m/z611.161 46，保留时间6.07 min，分子式C27H32O16，主要碎片离子为m/z119、287、259、m/z205，其中m/z287[M-H-2Glu]-是由分子离子于a、b位断裂脱去2 Glu中性碎片所产生的碎片离子；m/z259比m/z287少28，推测为CO的中性丢失，连续丢失3分子水后生成m/z205；m/z205于c位断裂后，生成m/z119。与对照品比对，鉴定为羟基红花黄色素A。

41准分子离子m/z285.039 55，保留时间13.98 min，分子式C15H10O6，分子离子在a位发生RDA裂解后产生m/z133碎片离子，m/z117比m/z133少16，故推断后者脱氧产生m/z117，并于b位断裂产生了m/z93。与对照品比对，鉴定为山柰酚。

25准分子离子m/z623.160 34，保留时间9.64 min，分子式C28H32O16，通过中性丢失鼠李糖基(308Da)产生m/z315；离子m/z300比m/z315少15，推测后者丢失CH3产生m/z300；m/z300发生RDA裂解，产生m/z153，后者脱去一分子O后又产生了m/z135。与对照品比对，鉴定为异鼠李素芸香糖苷。

3.4 萜类 裂解途径见图3。

图3 M11、M41、M18、M28、M2、M21二级质谱图及裂解规律

18准分子离子m/z479.154 48，保留时间7.95 min，分子式C23H28O11;分子离子于a位脱去一分子氧后产生m/z463，进而在b位脱去蒎烷基本骨架产生m/z165、135的互补离子对；离子m/z121比m/z135少14，故推测后者脱去CH2后产生前者。与对照品比对，鉴定为芍药苷。

28准分子离子m/z497.16537，分子式C23H30O12；分别于a、b位发生断裂产生的二级碎片离子m/z167[M-H-C15H22O8]-、123[M-H-C15H22O8-CO2]-与上述裂解规律相同。与对照品比对，鉴定为6-O-香草酰基筋骨草醇。

22、29在负离子模式下均检测到了由糖基6号位脱去的没食子酰基产生的碎片离子m/z169，以及苯甲酰基碎片所产生的离子m/z121，判断两者为没食子酰芍药苷或其异构体。

33在负离子模式下产生的碎片离子m/z463、121、165均与芍药苷裂解规律相同。与对照品比对，鉴定为芍药内酯苷。

30、35、36～39、42二级碎片离子均与上述裂解规律相同，或与相关文献报道一致。与对照品比对，分别鉴定为地黄苦苷、芍药新苷、地黄苷或其异构体、牡丹皮苷B。

3.5 鞣质类 裂解途径见图3。

2准分子离子m/z463.118 99，保留时间1.67 min，分子式C19H26O15；分子离子在a位断裂脱去蔗糖后产生m/z169，由于m/z125比m/z169少44，推测后者脱去一分子CO2后产生前者。与文献[21]比对，鉴定为没食子酰蔗糖。

32、34二级质谱内均发现了阿魏酰基的碎片离子，两者裂解行为与没食子酰蔗糖类似。与文献[14]比对，鉴定为6-O-E-阿魏酰基筋骨草醇或其异构体。

3.6 苯乙醇苷类 裂解途径见图3。

21准分子离子m/z623.196 90，保留时间9.27 min，分子式C29H36O15；二级碎片离子有m/z179、161、315、135；分子离子由a位断裂产生咖啡酸离子m/z179，进而脱去一分子H2O生成碎片离子m/z161；离子m/z315[M-H-caffeoyl-C6H10O4]-是由分子离子依次脱去咖啡酰基、鼠李糖残基产生，再继续丢失一分子葡萄糖并脱水后得到m/z135[M-H-caffeoyl- C6H10O4-Glu-H2O]-。与对照品比对，鉴定为毛蕊花糖苷。

27质谱中展现了与毛蕊花糖苷相同的裂解方式。与对照品比对，鉴定为异毛蕊花糖苷。

3.7 其他 通过数据库分析结合文献比对，鉴定9、24、26、31、44～46分别为hamnopyranosyl vanilloyl、焦地黄苷B1、焦地黄苷B2、eriodictyol hexoside、十八烯酸或其异构体。

4 讨论

桃红四物汤作为传统调经要方之一，具有活血化淤、调经止痛等功效。咖啡酰奎尼酸类化合物对于改善局部血液微循环有着显著效果[28]，临床用于急性脑卒中患者的治疗。金鸣等[29]发现羟基红花黄色素A通过拮抗PAF受体，缓解PAF诱发人脐静脉血管内皮细胞炎症介质白细胞介素(IL)-1B、IL-6、ICAM-1和VCAM-1mRNA的升高，达到镇痛的效果。吴丽等[30]研究表明芍药苷对原发性痛经模型小鼠具有解痉镇痛作用，能使小鼠潜伏期延长、扭体次数减少，子宫组织PGF2水平降低、NO水平升高。本研究鉴定成分与桃红四物汤传统药效的重叠性，证实了药效化学成分在桃红四物汤内的传递性与可测定性。

综上所述，桃红四物汤物质基准具成分特有性且关联药效，与刘昌孝院士提出的中药质量标志物(Q-marker)理论[31]不谋而合。本研究利用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术对桃红四物汤物质基准进行分析鉴定，初步鉴定并推测出了毛蕊花糖苷，芍药苷，地黄苦苷，羟基红花黄色素A，5-O-咖啡酰奎尼酸，对香豆酸等48种成分。为探明桃红四物汤质量标志物提供了原始数据库，为提升桃红四物汤质量标准水平打下了基础。