不同核酸提取方法SARS-CoV-2核酸检测性能比较

2022-06-15 06:51李俊平
健康体检与管理 2022年5期
关键词:符合率阴性试剂

【摘要】目的:研究不同核酸提取方法在SARS-CoV-2核酸检测中的应用性能。方法:选取3种经过预处理的核酸提取试剂作为观察对象,分别使用磁珠吸附法、样本释放剂A、样本释放剂B其进行提取,获取阴性样本、阳性样本,通过RNA技术获得20%~28%稀释度的SARS-CoV-2标准品,并使用荧光逆转录聚合酶反应(RT-PCR)对其进行检测,由此获得Ct值,随后评估不同提取方法下SARS-CoV-2核酸的检测性能。结果:不同核酸提取方法下,SARS-CoV-2试剂的阴性样本、阳性样本的检测符合率均是100%,使用磁珠吸附法获得的核酸样本变异系数(CV)与样本稀释法(A、B)比较降低,样本稀释剂A的CV值最大,稀释剂B的CV值次之。使用磁珠吸附法与样本释放剂B获得的核酸检出限为156mg/ml,低于样本释放剂A的检出限625.0mg/ml。结论:在SARS-CoV-2核酸试剂检测中,使用磁珠吸附法对试剂的提取效率更高,并且重复性好,在大批量SARS-CoV-2试剂样本检测中,可推广该提取方法。

【关键词】核酸检测方法;不同提取方法;SARS-CoV-2;检测性能

新冠病毒肺炎(COVID-19)的致病原为SARS-CoV-2,根据我国卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第7版)规定,通过RT-PCR检测SARS-CoV-2阳性即为新冠病毒感染患者。在具体检测中,相關人员按照试剂检测说明书,在磁珠吸附法的作用下,将采集的鼻咽拭子存放在保存液中,使用56℃的灭活疫苗,培养30min后,提取自动化设备,以聚合酶反应,对PCR模板进行扩增,以获取阳性样本。该方法的检测效率较高,并且操作便利、检测时间较短,具有推广价值。

1资料及方法

1.1一般资料

10例阳性样本资料为广州邦德盛公司提供的SARS-CoV-2RNA标准品,其浓度为2.0*106mg/ml,病毒核酸编号分别为GBW(B)092244、GBW(B)092243,10例阴性样本来源于健康体检者咽拭子。

使用的样本释放剂A为国盛医学科技有限公司提供。样本释放剂B阿、磁珠吸附法所用核酸提取试剂均来源于达安基因有限公司。检测所用的荧光定量PCR仪来源于瑞士罗氏公司。

1.2方法

根据核酸提取说明书,以样本释放剂A、样本释放剂B提取样本,将样本置入到采样管中灭活、对其进行震荡离心、选取上层清液作为PCR模板,并对其进行扩增。

参考磁珠吸附法、核酸提取试剂说明书,使用核酸提取仪器完成对CoV-2 RNA的自动提取,选取200μL的样本与核酸洗脱液体100μL,按照吸附法一般流程,对其进行吸附操作,并完成对样本的制备。

在具体操作中,使用RT-PCR实时荧光法与试剂盒,对制备后的SARS-CoV-2核酸进行检测,为实现理想的检验结果,需要对荧光RT-PCR的条件进行规定,第一次温度控制在50℃、时间为15min、第二次温度为90℃,时间为15min;第三次温度为55℃,吸附时间为45s。

1.3观察指标

观察检测结果符合率、判定检测结果为阳性、阴性的例数。其中阳性标准为FAM通道有明显扩增曲线,且循环阈值Ct≤40;阴性标准为FAM通道无扩增曲线,且Ct值>40。

2结果

2.1阳性与阴性符合率比较结果

采样人员使用不同方式采集了10例健康人群的咽拭子样本,其检测结果为阴性,阴性符合率为100%;对阳性样本进行检测分析,分别使用释放剂A、B与磁珠吸附法,对阳性样本进行复检,其中结果为阳性的样本为10例,符合率为100%。

2.2有关重复性指标的对比分析

对低值品与中值品进行核酸提取与扩增,利用磁珠吸附法和样本释放剂进行重复性检查,结果见表1:

2.3不同提取方法下的检出率比较

以磁珠吸附法提取核酸后,对N基因的检出率为100%,ORFlab基因的检出率为96.85%,采用样本释放剂A提取核酸后,N基因检出率为83.18%,ORFlab基因的检出率为76.82%,使用样本缓放剂B进行核酸提取后,N基因的检出率为100%,ORFlab基因的检出率为96.28%。

3讨论

COVID-19成为公共突发卫生事件,具有传播广泛的特点,对人民群众的健康构成威胁,目前,对COVID-19的检测方式为实时荧光RT-PCR标记,其样本的提取方式主要是磁珠吸附法。磁珠吸附法是通过蛋白变性剂使得样本中的蛋白质达到溶解状态,使得核酸被解离出来,并在磁场和重力的作用下,将杂质去除掉,最后获取较为纯净的核酸样本。样本试剂的主要成分为核酸释放液与保存液,在试剂作用下能够促使蛋白质结构变性。

采样完成后,操作人员需要严格按照试剂采样说明书,对样本进行震荡、静置与离心,吸取上层清液作为本次检测样本,将其置于PCR体系中,进行扩增。理论上分析,病毒载量越大,则提取的病毒核酸量越多,这一现象在检测结果的Ct值上有所体现。牛卫东、段江洋、蒋诗苑以咽拭子和鼻试子为主要方式对患者痰液中的SARS-CoV-2核酸进行了检测,通过PCR获取Ct值,其检测结果一致性(符合率)与检出率与本文研究结果高度相似。

综上所述,使用磁珠吸附法检测SARS-CoV-2核酸效果良好,与样本释放剂A、B比较,其符合率更高、重复性好,可对磁珠吸附法进行推广。

参考文献

[1]沈利华,黄菲,陈祥,等.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒临床诊断效能评估[J].浙江大学学报:医学版,2020,49(2):6.

[2]牛卫东,段江洋,蒋诗苑,等.咽拭子,鼻拭子,痰液中SARS-CoV-2核酸检测结果一致性及检出率分析[J].传染病信息,2020,33(4):5.

作者简介:李俊平(1979.10-)女, 汉族,山东省聊城市高唐县人,本科学历,主管检验师,研究方向:医学检验。

猜你喜欢
符合率阴性试剂
玉簪属种质资源收集筛选及耐阴性研究
口服等渗甘露醇多层螺旋CT小肠造影的临床应用研究
多层螺旋CT与MRI在肝脏肿瘤鉴别诊断中的应用价值
“四指定”脱离实际 有碍实验创新
高中生物学中几种特殊试剂的应用
物质鉴别题的解题方略
高一化学综合检测题