一测多评法同时测定六味地黄丸中8种成分

李 艳， 侯媛芳， 伍永富， 谈利红， 穆祯强， 杨 林,4*

(1.重庆医药高等专科学校，重庆 401331；2.毒性中药给药系统重庆市重点实验室，重庆 401331；3.太极集团重庆中药二厂有限公司，重庆 402284；4.重庆市药物制剂工程技术研究中心，重庆 401331)

六味地黄丸是滋阴补肾的经典名方，由熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻6味药材组成，具有滋阴补肾的功效，用于治疗肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、遗精盗汗。但国家药品监督管理局发布公告(2021年第23号)[1]，指出六味地黄制剂有腹泻、腹痛、腹胀、恶心、呕吐、胃肠不适、食欲不振、便秘、瘙痒、皮疹、头痛、心悸、过敏等不良反应，要求药品上市许可持有人应当对新增不良反应发生机制开展深入研究。

2020年版《中国药典》一部对六味地黄丸的含量控制指标为莫诺苷、马钱苷、丹皮酚[2]，数量较少，难以全面准确地反映其质量；也有研究采用HPLC法同时测定六味地黄丸中多种有效成分含量[3-7]，但所需对照品数量多，耗费大，检测成本昂贵。目前，一测多评法已在中药制剂的质量控制中广泛应用[8-12]，但鲜有用于六味地黄制剂，而且定量指标较少[13-14]。本实验综合考虑成分有效性[15-20]、可测性、对照品易得性等方面，采用一测多评法同时测定六味地黄丸中没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚的含量，以期为该制剂质量评价提供参考，也为研究其不良反应机制奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，配置Waters 2998 PDA检测器(美国Waters公司)；ME55电子天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；FA2204B电子天平(万分之一，上海天美天平仪器有限公司)；800B多功能粉碎机(永康市速锋工贸有限公司)；SB25-12DTN超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q integral-3超纯水机(美国Merck Millipore公司)。

1.2 试剂与药物 没食子酸(批号110831-201605，纯度90.8%)、5-羟甲基糠醛(批号111626-201912，纯度99.2%)、莫诺苷(批号111998-201602，纯度96.3%)、当药苷(批号111742-200501，纯度100%)、马钱苷(批号111640-201808，纯度99.0%)、芍药苷(批号110736-201943，纯度95.1%)、丹皮酚(批号110708-201407，纯度99.9%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；山茱萸新苷对照品(批号19080905，纯度98.0%)购自成都普菲德生物技术有限公司。六味地黄丸(浓缩丸)共21批，购自太极集团重庆中药二厂有限公司，批号分别为1904086、1905103、1905109、1907154、1907155、1910224、2002033、2003039、2003040、2003041、2003042、2003043、2004062、2005069、2005071、2005075、2005076、2005078、2005079、2005080、2006086。甲醇、乙腈为色谱纯，均购自成都市科隆化学品有限公司；磷酸为色谱纯，购自重庆川东化工(集团)有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，5%～8%A；5～20 min，8%A；20～35 min，8%～20%A；35～45 min，20%～60%A；45～55 min，60%A；55～56 min，60%～95%A；56～60 min，95%A；60～61 min，95%～5%A；61～66 min，5%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长240 nm；进样量20 μL。色谱图见图1。

1.没食子酸 2.5-羟甲基糠醛 3.莫诺苷 4.当药苷 5.马钱苷 6.芍药苷 7.山茱萸新苷 8.丹皮酚1.gallic acid 2.5-hydroxymethyl-2-furaldehyde 3.morroniside 4.sweroside 5.loganin 6.paeoniflorin 7.cornuside 8.paeonol图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚对照品适量，70%甲醇溶解并稀释成系列质量浓度，即得。

2.3 供试品溶液制备 取本品适量，粉碎2 min，取粉末约1.65 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇约40 mL，超声提取1 h，放冷，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 系统适用性与专属性试验 精密吸取对照品、供试品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，在200～400 nm波长处进行全扫描，结果见图1。由此可知，供试品溶液色谱图在对照品溶液色谱图相应位置处有色谱峰，其光谱特征与对照品一致，峰纯度检测均符合要求(纯度角度小于纯度阈值)，分离度良好(均大于1.5)，理论塔板数均不低于3 000。

2.5 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下对照品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.6 相对校正因子计算 精密吸取“2.2”项下对照品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进

表1 各成分线性关系

样测定，以丹皮酚为内标，计算其他7种成分的相对校正因子fk/s，公式为fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子

2.7 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚峰面积RSD分别为0.33%、0.30%、0.24%、0.25%、0.30%、0.32%、0.28%、0.26%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取同一批本品(批号1905109)，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚含量RSD分别为0.93%、0.65%、0.62%、0.61%、0.95%、0.78%、0.55%、0.25%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号1905109)，室温下于0、4、8、12、18、24、36 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚峰面积RSD分别为0.44%、0.59%、0.34%、0.31%、0.22%、0.92%、0.49%、0.13%，表明溶液在36 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品(批号1905109)粉末9份，每份约0.825 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，分成3组，每组3份，分别按80%、100%、120%水平精密加入对照品溶液(没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚质量浓度分别为1.539、0.890、1.501、0.416、1.302、0.686、0.302、1.077 mg/mL)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚平均加样回收率分别为102.2%、100.9%、101.6%、99.0%、101.9%、100.8%、100.0%、102.1%，RSD分别为0.51%、1.3%、0.93%、1.2%、1.5%、1.7%、0.67%、0.82%。

2.11 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响 取“2.2”项下对照品溶液，考察Waters e2695、Agilent 1260 InfinityⅡ、Shimadzu Nexera X2色谱仪及Phenomenex Luna C18、Waters Sunfire C18、Wondasil C18-WR色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响(RSD<5%)。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

2.12 色谱峰定位 取“2.2”项下对照品溶液，以丹皮酚色谱峰为参照，计算其他7种成分相对保留时间，结果见表4，可知它们在不同仪器、色谱柱下稳定性良好(RSD<5%)。因此，本实验采用相对保留时间进行色谱峰定位。

表4 各成分相对保留时间

2.13 样品含量测定 取21批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含量，再采用t检验进行统计学分析，结果见表5，可知2种方法所得结果无显著差异(P>0.05)。

3 讨论

3.1 色谱条件选择 流动相采用乙腈-0.2%磷酸并进行梯度洗脱，相对于2020年版《中国药典》中的乙腈-0.3%磷酸，降低了酸性，更有利于延长色谱柱使用寿命。再采用二极管阵列检测器进行全波长扫描，发现各成分在240 nm波长处均有较大吸收，为了兼顾响应值，选择该处作为检测波长。

3.2 内标选择 选择内标时，应遵循性质稳定、价廉、易得、低毒、有效的原则。本实验发现，丹皮酚含量高，性质稳定，无毒，对照品廉价并易得，色谱峰峰形最优，故选择其作为内标。

3.3 供试品溶液制备方法选择 本实验发现，50%甲醇、70%甲醇、甲醇加热回流提取1 h时，70%甲醇提取效率最高，但低于超声提取相同时间；3种溶剂超声提取1 h时，甲醇超声提取效率最低，而且莫诺苷、马钱苷峰形差，出现拖尾、前沿分裂现象，无法满足分析要求，其原因是甲醇与初始比例流动相(5%乙腈)极性相差过大而引起的溶剂效应，虽然50%、70%甲醇提取效率无显著差异，但50%甲醇提取1 h后微孔滤膜过滤溶液困难，可操作性差。最终，选择70%甲醇超声提取1 h作为供试品溶液制备方法。

表5 各成分含量测定结果(mg/丸，n=2)

4 结论

本实验采用一测多评法同时测定丹皮酚、没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷的含量，该方法简便准确，所得结果与外标法接近，可为该制剂全面科学的质量评价提供参考。