林氏消化液和厚金格尔消化液水解结果与运用比较

2022-06-16 08:19詹益雄徐江峰李方丽翁雅倩瞿明霞
农产品加工 2022年10期
关键词:消化液林氏水解

詹益雄,徐江峰,李 浪,李方丽,翁雅倩,车 腾,瞿明霞

(武汉生物制品研究所有限责任公司,湖北武汉 430207)

在菌苗类培养基中,通过胰酶消化牛肉得到的蛋白胨作为氮源被广泛使用,如用林氏消化液制作白喉杆菌培养基,用厚金格尔消化液制作脑膜炎奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌培养基[1]。多年来的培养结果证实胰酶消化牛肉的蛋白胨是质量稳定、高效的基础营养成分。通过胰酶消化牛肉得到的消化液通过喷雾干燥制得的干粉,也开始在国内运用。各疫苗生产单位在生产牛肉胰酶消化液类产品的工艺上不尽相同,大多在原始制法上做过改良;由于各单位该类产品品种少,并未形成统一标准,通过分析林氏消化液和厚金格尔消化液的制作和水解结果,结合其使用范围,为该类消化液运用和质量标准建立提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胰酶粉(1∶250,BR);上海瑞永生物科技有限公司提供;20%氢氧化钠溶液,自备;新鲜黄牛肉,市售。

1.2 检测用试剂、主要仪器设备

1.2.1 检测用试剂

磷酸盐标准缓冲液(pH 值6.86)、硼砂标准缓冲液(pH 值9.18)、0.85%生理氯化钠溶液、2%硼酸溶液、30%氢氧化钠溶液、消化剂、0.1 mol/L 硫酸溶液和1 mol/L 氢氧化钠溶液、0.05 mol/L 盐酸溶液、溴百里香酚蓝指示剂、0.5%酚酞指示剂、硼酸盐缓冲盐水。

1.2.2 仪器设备

电子天平、pH 计(赛多利斯pb-10)、Buchi 自动凯氏仪(K-370,系列号1000073773)、恒温水浴箱等。

1.3 试验方法

1.3.1 林氏消化液制备

新鲜黄牛肉经过除脂、除筋膜、清洗、搅碎处理后,将20 000 g 新鲜碎黄牛肉加注射用水定容至60 L,加温至90~100 ℃后,降温至50~55 ℃,并维持恒温50~55 ℃,不断搅拌,消化过程中用20%氢氧化钠溶液调整pH 值并维持pH 值7.8~8.0。计时,胰酶粉分4 次加入,前3 次加入2/7,后1 次加入1/7,每隔30 min 加胰酶粉1 次,共加胰酶粉480 g。水解2.5 h 后,加入冰醋酸1 500 mL,煮沸后澄清过滤,取样,灭菌,检测AN 值、TN 值。

1.3.2 厚金格尔消化液制备

新鲜黄牛肉经过除脂、除筋膜、清洗、搅碎处理后,将20 000 g 新鲜碎黄牛肉加水定容至70 L,煮沸30 min,冷却至50~55 ℃,并维持恒温50~55 ℃搅拌,消化过程中用20%氢氧化钠溶液调整pH 值并维持pH 值7.8~8.0,胰酶粉分2 次加入,每次加入胰酶粉160 g,每隔30 min 加胰酶粉1 次,共加胰酶粉320 g。在加入20%氢氧化钠溶液调整pH 值,且2 次测量(测量间隔≥15 min),在pH 值7.8~8.0 时,转移至38 ℃密闭抑菌条件下,水解240 h,每12 h搅拌1 次,水解完成后取出煮沸,澄清过滤,取样,灭菌,检测AN 值、TN 值。

1.3.3 水解度计算和分析

用滴定法(加中性甲醛,与α - 氨基作用后,再以氢氧化钠溶液滴定羧基) 确定样品氨基氮含量。用Buchi 自动凯氏仪(半微量法) 测定样品总氮。水解度值按照AN/TN 计算。

2 结果与分析

2.1 AN 值和TN 值检测结果

林氏消化液共得到24 批次检测数据,厚金格尔消化液共得到24 批次检测数据。

AN 值和TN 值检测结果见表1。

表1 AN 值和TN 值检测结果

2.2 AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值计算

分别计算林氏消化液和厚金格尔消化液的AN 平均值和TN 平均值,两者比值为AN/TN 值。2 种消化液AN/TN 值极显著差异性(p<0.01)。

AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值见表2。

表2 AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值

2.3 林氏消化液和厚金格尔消化液运用比较

统计2 种消化液,林氏消化液使用范围较窄,主要用于白喉杆菌、肉毒杆菌、水肿梭菌、溶组织梭菌的培养基氮源;厚金格尔消化液使用范围较广,主要用于金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、白色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒甲沙门氏菌、副伤寒乙沙门氏菌、百日咳杆菌、霍乱、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、土拉伦菌、甲型溶血性链球菌的培养基氮源。比较AN/TN 值,得出更高水解度的消化液适用范围更广。

3 结论

对林氏消化液和厚金格尔消化液的水解液AN 值和TN 值进行检测,通过AN 值和TN 值平均值计算的AN/TN 值得出,厚金格尔消化液AN/TN 值比林氏消化液AN/TN 值高14.54%。比较林氏消化液和厚金格尔消化液工艺,温度是变量,温度升高加速水解反应过程[2];厚金格尔消化液制作后期是密闭抑菌消化,通过检测发现随着消化时间延长其pH 值为7.0~7.8 呈缓慢下降趋势,不在胰酶最佳消化pH 值范围内[3-4],也为水解不利因素,不计上述2 项不利因素作用,消化时间对水解的正向作用仍明显。厚金格尔消化液前期50~55 ℃消化阶段平均为1.5 h,在进入后期消化前,未进行AN 值和TN 值检测,以及后期240 h 的消化分子量变化趋势未进行检测,该部分趋势尚需再通过试验进行研究。

林氏消化液主要用于白喉杆菌、魏氏梭菌、气性坏疽、肉毒梭菌等的培养基制作,厚金格尔消化液主要用于霍乱弧菌、鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、炭疽热杆菌、土拉杆菌、志贺菌、百日咳、甲型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、奈瑟氏菌、伤寒杆菌等的培养基制作[1]。大多数革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对于基础液的水解度要求更低,即革兰氏阴性菌深层培养的基础液水解度更低。革兰氏阳性菌深层培养大多选用类似于林氏消化液的基础营养液,如破伤风梭菌的深层培养选用的基础液是牛肉胃酶消化液,在现阶段常见基础液中水解程度几乎为最低;革兰氏阴性菌的深层培养大多选用类似于厚金格尔消化液,或者相似水解程度的干酪素水解液[5-6],有些甚至直接用全综合培养基培养,如无细胞百日咳疫苗生产时所用的SSM培养基或者其改良培养基[7-11]。这些事例反映细菌营养条件在不同胨或者氮源的分子量方面是不同的;在氮源替换试验上或者培养基改良上,应重视氮源成分的分子量分布。另外,现阶段各疫苗生产厂家对培养基的改良试验频繁且迅速,仅仅追求深层培养菌体数量的增多尚不能体现培养基改良试验的成功,抗原性的保持也是培养基改良试验面临的新课题[12]。

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