高龄孕妇的染色体微阵列分析应用

郭君荣，刘丽

（重庆医科大学附属第二医院妇产科，重庆 400010）

自2016 年起，中国实施全面两胎政策，高龄孕妇（预产期年龄≥35 岁）人数急剧增加，而孕妇年龄的增长与胎儿染色体异常的发生率具有较明确的相关性[1]。根据国家卫生健康委2002 年与2019 年颁布的《产前诊断技术管理办法》[2]，建议年龄超过35周岁的孕妇应进行产前诊断。然而，产前诊断在高龄孕妇中的应用普及率并不理想[3]，也没有专门针对高龄孕妇建立的产前诊断模式。

染色体核型分析技术是目前产前诊断的“金标准”，它可检测出非整倍体、不平衡重排等多种染色体异常，但该技术具有分辨率低、费时、费力等局限性[4]。近年来，染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）在 临 床 的 应 用 范围逐渐广泛，其分辨率是传统核型分析的10 ～100 倍或100 倍以上，它可检测出小的亚显微缺失和重复的染色体拷贝数变异（copy number variations，CNVs）等[5]。然而，CMA 检查在高龄孕妇产前诊断中的价值还有待明确。

本研究通过分析498 例高龄孕妇的羊水CMA 检测结果，比较了CMA 在单纯高龄与合并其他高危因素的高龄（非单纯高龄）孕妇中的染色体异常检出差异，并探究了不同高危因素在高龄孕妇胎儿染色体异常中的潜在意义。

一、方法

（一）一般资料

2018 年1 月至2020 年12 月于重庆医科大学附属第二医院接受介入性产前诊断的单胎高龄孕妇498例。所有病例均符合介入性产前诊断指征，包括高龄、超声异常、不良妊娠史、非侵入性产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）异常、父母染色体异常等。本研究已得到医院伦理委员会批准和患者及家属知情同意。

（二）标本采集

患者均在彩超引导下行经腹羊膜腔穿刺，抽取30ml 羊水，取质控合格的羊水基因组DNA 200ng，依次变性、复性、杂交、片段化处理，收集DNA 沉淀。采用Human SNP-12 BeadChip Kits （Illumina，America）芯片，将重悬的片段化DNA 溶液载入芯片，于密闭杂交盒内进行杂交，洗除芯片上未杂交和非特异杂交的DNA 片段，进行延伸和染色，洗涤后晾干。

（三）CMA结果判读

分别采用I s c a n 扫描系统进行数据采集和Karyostudio软件进行分析，获得包括400kb及以上的缺失、重复及10Mb以上的LOH片段及大于等于30%的嵌合现象。通过与DECIPHER、OMIM、ClinGen、DGV、NCBI等公共数据库比对分析及参考文献的检索，判断所检出CNVs的性质。拷贝数变异致病性的判读参照美国医学遗传学学会指南分为致病性CNVs、可能致病CNVs、临床意义未知CNVs、可能良性CNVs以及良性CNVs[6]。

（四）统计分析

数据分析采用SPSS20.0 软件，所有数据经正态性检验，本研究数据均符合正态分布，对于符合正态分布的数据采用均数±标准差进行表示；采用独立样本t 检验比较两组连续性变量差异；采用卡方检验比较两组染色体异常率差异；检验水准为0.05。

二、结果

（一）患者特征差异与CMA检测总体结果

一共498 例高龄孕妇接受了CMA 检测，其中单纯高龄组孕妇401 例，平均年龄37.93±2.557，平均孕周19.73±4.009；非单纯高龄组孕妇97 例，平均年龄37.45±2.354，平均孕周20.39±2.650；两组孕妇的年龄和孕周均不具有显著性差异（P＞0.05），因此组间具有可比性。

所有样本CMA 检测结果均符合质控要求，检测成功率100%。在498 例样本中，共检出49 例（9.8%）胎儿染色体异常，其中染色体数目异常10 例（2.0%），包括6 例21 三体，2 例47，XYY，1 例45，X，1 例45，X 嵌合体。致病性或可能致病性CNVs 6 例（1.2%），临床意义不明CNVs 33 例（6.6%）。

（二）单纯高龄组及非单纯高龄组孕妇的胎儿染色体异常检出率差异

单纯高龄组孕妇样本共401 例，检出胎儿染色体数目异常3 例（0.7%）（2 例21 三体，1 例45，X 嵌合体），致病性或可能致病性CNVs 4 例（1.0%），临床意义不明CNVs 25 例（6.2%），总计染色体异常32 例（8.0%）。非单纯高龄组孕妇样本共97 例，检出胎儿染色体数目异常7 例（7.2%）（4 例21 三体，2 例47，XYY，1 例45，X），致病性或可能致病性CNVs 2 例（2.1%），临床意义不明CNVs 8 例（8.2%），总计染色体异常17例（17.5%）。非单纯高龄组的染色体数目异常率（P ＜0.001）、总计染色体异常率（P=0.005）均明显高于单纯高龄组，两组的致病性或可能致病性CNVs、临床意义不明CNVs 检出率无明显差异（P＞0.05），见表1。

表1 单纯高龄组及非单纯高龄组孕妇的胎儿染色体异常检出率比较

（三）高龄合并其他高危因素时胎儿染色体异常检出情况

在非单纯高龄组中，高龄合并不同高危因素孕妇的胎儿染色体异常检出情况如表2 所示。合并NIPT异常组的总体染色体异常6 例（33.3%），合并超声异常的总体染色体异常7 例（21.9%），合并不良接触史总体染色体异常1 例（12.5%），合并不良孕产史的总体染色体异常3 例（11.1%），而合并父母染色体异常的总体染色体异常检出率为0，合并唐筛异常总数较少，未检出染色体异常。

表2 高龄合并不同高危因素孕妇的胎儿染色体异常检出情况

（四）高龄孕妇妊娠结局分析

49 例检出胎儿染色体异常的孕妇均进行遗传咨询，染色体数目异常孕妇中，2 例47，XYY 胎儿出生，外观 无明 显 异 常；6 例21 三体、1 例45，X 及1 例45，X 嵌合体胎儿均行引产。随访6 例致病性或可能致病性CNVs 结果如下：其中4 例直接行引产；1 例行家系分析后提示新发突变，行引产；1 例行家系分析后提示母系遗传，继续妊娠，新生儿6 月龄时随访未见明显异常，见表3。33 例临床意义不明CNVs 胎儿中，1 例行家系分析提示新发突变行引产，1 例因孕妇肠梗阻行引产，另外31 例胎儿均活产，胎儿出生后6 个月时随访未见明显异常。

表3 CMA检出的致病性或可能致病性CNVs

三、讨论

我国是出生缺陷高发国，据《中国出生缺陷防治报告（2012）》估计，我国出生缺陷总发生率约为5.6%[7]。高龄是出生缺陷的重要风险因素，中国高龄孕妇人数从2011 年的10%上升至了2016 年的20%[8]，为此，国家将高龄妊娠作为产前诊断的标准之一[2]。然而，国内外仍有大量高龄孕妇对产前诊断持有负面态度，一项中国的单中心研究显示，超75%的高龄孕妇直接拒绝接受羊水穿刺[3]，而国外研究也有类似报道[9，10]，这可能与NIPT 的普及和孕妇及家属对侵入性产前诊断方式的利弊认知度不够有关。NIPT 是一项产前筛查新技术，它通过大规模平行测序分析来自母体血浆的游离胎儿DNA，可以识别非整倍体（尤其是21 三体）等常见染色体异常[11]。临床实践中，大多数高龄孕妇因顾虑侵入性产前诊断的风险而愿意接受NIPT 检查。但值得一提的是，既往研究显示，12.4%-45%的染色体异常不能通过NIPT 检查到，只能通过侵入性诊断检测到[11，12]。因此，针对高龄孕妇群体，医生应建议其行产前诊断并帮助其选择适当的产前诊断方式，这一举措对于降低出生缺陷，提高人口素质具有重要的意义。

CMA 技术又称基因芯片技术，它通过成千上万个探针与样本进行杂交，从而产生荧光信号来反映DNA 的表达水平，是产前诊断的重要检查手段。本研究通过比较单纯高龄孕妇与非单纯高龄孕妇CMA结果，发现非单纯高龄孕妇的总体胎儿染色体异常率与染色体数目异常率明显高于单纯高龄组，同样，Wu等人[13]也报道伴有超声异常的高龄孕妇染色体异常率明显高于单纯高龄孕妇。然而，我们的研究并没有观察到致病性或可能致病性CNVs 在两组间的差异，这可能因其发病率较低，本研究的样本量不足以观察到差异所致。

本研究分析了非单纯高龄组中不同高危因素与胎儿染色体异常的相关性，我们发现，合并NIPT 异常或超声异常的高龄孕妇染色体异常率最高，另一方面，约三分之一的NIPT 异常高龄孕妇的胎儿确定出现了染色体异常，提示NIPT 具有一定的假阴性或假阳性的结果，再次明确了NIPT 的筛查性质。因此，我们建议NIPT 异常的高龄孕妇应接受侵入性检查进行胎儿染色体诊断，明确其是否真正合并胎儿染色体异常，避免不必要的引产。同样，超声异常、不良接触史及不良孕育史的高龄孕妇也出现11%-20%的染色体异常率，与既往研究报道基本一致[13-15]，合并此类高危因素的高龄孕妇应特别注意胎儿染色体异常的风险，除非合并侵入性产前诊断禁忌，均应接受产前诊断，可有效地预防和减少出生缺陷儿的出生。另外，因为唐氏筛查不适用于高龄孕妇，本研究中高龄合并唐筛异常的例数极少，统计分析意义不大。合并父母染色体异常的高龄孕妇胎儿染色体异常检出率较低，可能是由于本身样本量不足和部分孕妇胚胎植入前遗传学筛查有关，未来需要更大样本量研究阐明它们的关系。

CMA 在检测染色体微结构异常方面有得天独厚的优势，然而因检测出大量临床意义不明的拷贝数异常及发现神经发育障碍易感性位点等情况，在临床应用时可能引发额外的焦虑，因此CMA 技术应用于高龄孕妇时，充分的遗传咨询十分必要，适时进行双亲及家族成员的验证，寻找变异来源，很大程度上可缓解孕妇及家属的焦虑情绪，减少非必要的终止妊娠比率。

四、结论

通过以上研究，我们发现合并其他高危因素的高龄孕妇发生胎儿染色体异常的比率更高，若无产前诊断禁忌症，均应强烈建议其行侵入性产前诊断，明确是否合并胎儿染色体异常。