红细胞输注疗效和铁过载对再生障碍性贫血患者T淋巴细胞亚群的影响

朱琳超 孙菊琴 姚轶敏

再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）是一种由免疫介导的造血干细胞和造血微环境受损而导致骨髓造血衰竭的恶性血液病。AA的特点是骨髓造血干细胞增殖减少，导致外周血细胞减少，以贫血、出血和感染为主要临床表现。输血在AA患者的治疗中发挥着重要作用，但长期输血一方面会造成严重铁过载，进而损伤组织，最终导致内脏器官功能障碍，其病程和预后与铁过载程度有关[1-2]，另一方面可能造成输血无效。有研究发现，β-地中海贫血患者由于长期输血导致铁过载，进一步损伤组织器官功能从而显著影响疾病病程发展[3]。铁是一种必需的元素，在生命过程中发挥着重要作用，如DNA合成、能量代谢和氧气运输，然而，过量的铁会通过芬顿（Fenton）反应产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）损伤细胞[4-6]。因此，维持铁水平在正常范围非常重要。近年来，铁过载与免疫系统的关系受到越来越多的关注，免疫因子的失调增加了人体内铁过载的风险[7-8]。淋巴细胞是免疫系统的重要细胞。研究发现，铁过载可以通过增加ROS来调节T淋巴细胞的数量和功能[9]。另外，输血无效在依赖输血的血液病患者中非常常见，多数由免疫因素所导致[10]。笔者回顾了AA患者的临床资料、血清铁蛋白水平、T淋巴细胞亚群、输注疗效等参数，旨在探讨不同输注疗效对铁过载AA患者T淋巴细胞亚群的影响，以及T淋巴细胞与铁过载程度的相关性，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2019年1月至2021年5月浙江中医药大学附属第一医院门诊或住院AA患者158例。根据血常规、骨髓检查和骨髓活检确诊，符合张之南《血液病诊断及疗效标准》（第3版）中AA诊断标准[11]，所有患者均未行造血干细胞移植治疗，临床和实验室检查排除感染性疾病、免疫性疾病、骨髓移植和其他造血系统疾病。以铁蛋白＞1 000 μg/L定义为铁过载[12]。输血患者均符合临床输血指征（Hb＜70 g/L），输注的红细胞均由浙江省血液中心提供，所有纳入患者输注去白细胞悬浮红细胞后24 h内复查Hb。红细胞输注效果的判定：按输注协作组提出的实行标准[13]，Hb 升高预期值（g/L）=[供者 Hb（g/L）×输入量（L）/患者体重（kg）×0.085（L/kg）]×90%，其中输入量以全血量为标准，红细胞制剂折算为对应全血量；90%为检验误差。Hb升高值未达到预期值的80%为输注无效，Hb升高值达到或超过预期值的80%为输注有效，根据输注是否有效分为输注有效组82例和输注无效组76例。输注有效组男 33 例，女 49 例，年龄 15～82（47.2±16.4）岁；其中铁过载44例，非铁过载38例。输注无效组男28例，女 48 例，年龄 13～80（42.6±13.5）岁；其中铁过载 41 例，非铁过载35例。两组患者性别、年龄及铁过载患者比例的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 试剂与仪器 全自动血液分析仪为Beckman Coulter Gen.S LH780全自动血液分析仪及血常规配套试剂。流式细胞仪为Beckman Coulter FACSCantoⅡ五色流式细胞仪，单克隆抗体Cyto-STAT tetraCHROME CD45-FITC/CD3-PC5/CD4-PE/CD8-ECD（批号：6607073，规格 0.5 ml），单色鼠抗人单克隆抗体CD25-FITC（批号：IM1026，规格：0.5 ml）均购自美国 Beckman Coulter公司，Abbott C1600全自动生化分析仪及配套试剂购自美国Abbott公司。

1.3 方法

1.3.1 血常规检测 于清晨采集受检者静脉血2 ml，乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝，采用Beckman Coulter Gen.S LH780全自动分析仪检测血常规，于2 h内上机完成检测。

1.3.2 T淋巴细胞亚群检测 于清晨采集受检者静脉血2 ml，EDTA-K2抗凝，标本在采集后6 h内染色、上机检测。取流式管，加入10 μl不同荧光标记的单克隆抗体，加入外周血100 μl混匀，室温下避光放置20 min，加入溶血素2 ml，室温下放置20 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入2 ml PBS洗涤，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，500 μl PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测淋巴细胞亚群水平，包括 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD4＋/CD8＋、CD4＋CD25＋等 T 淋巴细胞。

1.3.3 血清铁蛋白检测 于清晨采集受检者静脉血4 ml于促凝管中，等血液凝固后3 500 r/min离心5 min后取血清，采用Abbott C1600全自动生化分析仪于6 h内完成检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；T淋巴细胞与铁过载程度的相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同输注疗效患者T淋巴细胞亚群检测结果的比较 两组患者T淋巴细胞亚群比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 不同输注疗效患者T淋巴细胞亚群检测结果的比较

2.2 输注有效组铁过载与非铁过载者T淋巴细胞亚群检测结果的比较 铁过载者CD3＋T淋巴细胞比例低于非铁过载者，差异有统计学意义（P＜0.05），其余T淋巴细胞亚群检测结果比较差异均无统计学意义（均 P ＞0.05），见表2。

表2 输注有效组铁过载与非铁过载者T淋巴细胞亚群检测结果的比较

2.3 输注无效组铁过载与非铁过载者T淋巴细胞亚群检测结果比较 铁过载者CD3＋T淋巴细胞比例低于非铁过载者，差异有统计学意义（P＜0.05），其余T淋巴细胞亚群检测结果比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表3。

表3 输注无效组铁过载与非铁过载者T淋巴细胞亚群检测结果比较

2.4 不同输注疗效患者CD3＋T淋巴细胞与铁蛋白的相关性分析 全体AA患者CD3＋T淋巴细胞与铁蛋白无相关性（r=0.095，P＞0.05），见图1。红细胞输注有效患者，CD3＋T淋巴细胞与铁蛋白呈负相关（r=-0.305，P＜0.05），见图2。红细胞输注无效患者，CD3＋T淋巴细胞与铁蛋白无相关性（r=0.024，P＞0.05），见图3。

图1 全体AA患者CD3+T淋巴细胞与铁蛋白相关性的散点图

图2 输注有效组患者CD3+T淋巴细胞与铁蛋白相关性的散点图

图3 输注无效组患者CD3+T淋巴细胞与铁蛋白相关性的散点图

3 讨论

AA是血液系统常见疾病，治疗依赖长期输注，输注一个单位红细胞含有大约100 mg铁，但铁排泄的生理机制尚不清楚[14-15]。输注的衰老红细胞被巨噬细胞吞噬，不稳定的细胞铁被释放到血浆中并与转铁蛋白结合，当转铁蛋白结合饱和后，非转铁蛋白结合的铁在不同器官积累导致铁过载，引起一系列临床并发症[16-17]。虽然铁过载对实质器官有明显的影响，但铁过载对造血系统的影响尚未阐明，其确切机制尚不清楚，越来越多的临床证据表明，铁过载对骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）和AA患者的造血功能有抑制作用，铁螯合治疗可以改善这一情况[18-19]。免疫异常是造成AA造血功能异常的主要原因，T淋巴细胞功能亢进，CD4+与CD8+T淋巴细胞亚群数量与比值改变，导致免疫功能发生改变，其免疫作用以造血细胞为靶细胞，最终造成全血细胞减少[20]。近年来，铁过载与机体免疫的关系受到越来越多的关注，研究发现铁过载可通过升高ROS损伤骨髓造血功能，包括直接对造血干细胞以及间接对造血支持间充质细胞的数量和功能损伤[21]。因此，一方面AA患者长期输注导致铁过载，铁过载对造血又有抑制作用，另一方面长期输注导致输注无效，这已成为临床一大难题。本研究分析免疫因素、输注疗效和铁过载3者之间的关系，初步探讨不同输注疗效对铁过载AA患者T淋巴细胞亚群的影响。

本研究发现，输注有效组与输注无效组的T淋巴细胞亚群差异均无统计学意义（均P＞0.05），提示输注疗效对T淋巴细胞亚群影响不大，因此课题组进一步对红细胞输注疗效进行分组，分别分析铁过载对T淋巴细胞亚群的影响，输注有效组与输注无效组结果均显示，铁过载患者CD3+T淋巴细胞比例较非铁过载均显著降低。Guan等[20]研究MDS患者发现铁过载组T淋巴细胞亚群紊乱，CD3+T淋巴细胞比例降低，同时淋巴细胞内ROS水平升高，这与本研究结果一致。铁过载促发氧化应激反应，增加的ROS通过多条信号通路，如p38 MAPK/p53和p21 WAF1/Cip1/Sdi1通路，对T淋巴细胞起调节作用，影响免疫功能，导致细胞凋亡[22]。AA患者由于铁过载导致ROS产生增加，促进T细胞衰老和凋亡增加，从而显著降低T细胞比例。基于以上结果，笔者进一步将试验对象分为3组，即AA患者、输注有效的AA患者和输注无效的AA患者，分别分析CD3＋T淋巴细胞与铁蛋白的相关性，发现输注有效组CD3＋T淋巴细胞与铁蛋白呈负相关，其他两组与铁蛋白无相关性，提示铁过载对输注有效的AA患者CD3＋T淋巴细胞影响较大。

综上所述，输注有效的AA患者铁过载对CD3＋T淋巴细胞影响较大，两者呈负相关，内在免疫因素会影响输注疗效，但输注疗效对铁过载和T淋巴细胞的相互作用起何作用的报道较少。笔者将进一步研究铁过载与T淋巴细胞相互作用的机制，以及输注疗效影响铁过载与T淋巴细胞关系的内在机制，为临床治疗AA患者铁过载导致的免疫功能紊乱以及减少输注无效提供理论依据。