宫颈高危型HPV感染患者阴道微环境及外周血免疫因子表达

高慧芬 林 琳 钱木英 韩春花 冯 琳

云南省曲靖市妇幼保健院(655000)

高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续性感染是引起宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的主要原因，早期筛查并积极干预意义重大[1]。阴道微环境改变、免疫抑制等多因素作用也与宫颈癌的发生及发展关系密切[2]。HR-HPV持续性感染所致慢性炎症反应为宫颈癌的发生创造了机会，而炎症-癌变转化过程中宫颈局部微环境在癌变过程中发挥着重要作用[3]。T淋巴细胞所介导的细胞免疫在宫颈病变的发生发展中具有重要作用，辅助性T 细胞(Th)则可通过分泌多种效应因子如白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)等而调节免疫应答，已有诸多研究表明免疫紊乱参与HPV感染-癌变转化[4]。本研究通过检测分析HR-HPV感染的宫颈癌前病变(CINI、CINII、CINIII)及宫颈癌患者的阴道微环境、外周血T淋巴细胞亚群、Th1/Th2细胞因子表达变化，探讨阴道微环境及免疫紊乱与HR-HPV持续感染及宫颈病变的关系，为宫颈病变及宫颈癌的防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年2月-2021年2月本院妇科就诊并经液基薄层细胞检测技术(TCT)、PCR-反向点杂交法HPV基因分型检查等确诊为HR-HPV感染患者250例，其中慢性宫颈炎50例，CIN150例(CINⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级各50例)，早期宫颈癌50例(按国际妇产科联盟/FIGO分期Ⅰa1期4例、Ⅰa2期6例、Ⅰb1期22例、Ⅰb2期18例)。另选同期体检健康女性50例为对照组，经检查HPV呈阴性，细胞学检查宫颈无异常，年龄与HR-HPV感染组相匹配(±5岁)。纳入标准： ①有性生活史；②有HR-HPV持续感染史；③怀疑有宫颈病变并经≥2名病理科医师诊断，诊断参照《妇产科学》(第9版)[5]；④非月经期、妊娠期、哺乳期且近1年内无计划妊娠。排除标准： ①合并自身免疫性疾病、其他恶性肿瘤；②合并生殖道畸形或其他严重疾病；③既往放疗、化疗等抗肿瘤治疗史；④近6个月有宫颈手术史、子宫切除术等；⑤近6个月接受激素、免疫激活剂或抑制剂治疗；⑥近2周内接受局部或全身抗病毒药物治疗。参与者均自愿且签署知情同意书，研究设计获得医院伦理委员会审核批准通过。

1.2 检查方法

1.2.1阴道微环境检查受试者均取材前72 h内禁性生活及阴道内用药、阴道冲洗。检查时取截石位，常规采集阴道后穹窿部位分泌物置无菌试管内，采用精密PH试纸测PH 值，pH值≤4.5为正常，>4.5为异常；采用涂片法检测阴道清洁度，并采用高倍显微镜进行观察，3、4度判定为异常；采用悬滴湿片法检测滴虫，采用革兰氏染色检测霉菌、线索细胞、乳酸杆菌情况。

1.2.2血液指标检测取晨受试者空腹静脉血肝素抗凝，1份于2～8℃离心取上清液，检测Th1/Th2细胞因子，指标包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ，均采用酶联免疫吸附法检测；另1份采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+，并计算CD4+/CD8+，正常参考范围为CD4+35%～55%，CD8+20%～30%，CD4+/CD8+1.4～2.0。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组一般资料比较

各组一般情况均无差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组一般资料比较

2.2 各组阴道微环境比较

各组滴虫、霉菌、线索细胞检出率无差异(P>0.05)；对照组阴道pH>4.5、阴道清洁度异常及乳酸杆菌阴性率均低于其余各组，且CINⅡ/Ⅲ组、宫颈癌组均高于宫颈炎组、CINⅠ组(均P<0.05)。见表2。

表2 各组阴道微环境指标比较[例(%)]

2.3 各组外周血T淋巴细胞亚群比较

CD4+、CD4+/CD8+对照组、宫颈炎组、CINⅠ～Ⅲ组及宫颈癌组依次降低(均P<0.05)，各组CD8+比较无差异(P>0.05)。见表3。

2.4 各组Th1/Th2细胞因子比较

宫颈炎组血清IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均高于对照组，IFN-γ/IL-4低于对照组(P<0.05)；宫颈炎组、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ组及宫颈癌组血清IL-2、IFN-γ、TNF-α、IFN-γ/IL-4逐渐降低，IL-4、IL-6、IL-10逐渐升高，CINⅠ组各项指标与宫颈炎组比较无差异(P>0.05)，其余各组均与宫颈炎组有差异(均P<0.05)。见表4。

表3 各组外周血T淋巴细胞亚群比较

表4 各组细胞因子水平比较

组别 例数Th2细胞因子 IL4(pg/ml) IL6(pg/ml) IL10(ng/ml) IFNγ/IL4对照组5025.41±0.5824.11±0.8137.19±9.621.57±0.52宫颈炎组5035.92±0.61①35.96±1.16①48.94±9.85①1.36±0.47①CINⅠ组5037.64±0.66①37.43±1.28①51.43±10.96①1.25±0.41①CINⅡ组5046.41±0.71①②③50.23±6.89①②③60.82±11.43①②③0.71±0.33①②③CINⅢ组5049.58±0.82①②③④69.43±7.92①②③④72.69±12.85①②③④0.68±0.29①②③④宫颈癌组5053.87±0.93①②③④⑤186.65±22.64①②③④⑤96.85±14.21①②③④⑤0.46±0.21①②③④⑤ F 51.942338.563120.832210.006 P 0.0000.0000.0000.000

3 讨论

HPV感染尤其是HR-HPV感染是宫颈癌发生及发展的关键病因，而HPV的致癌机制除与其型别、病毒致癌产物、基因等有关外，还与阴道微生态环境紊乱、病毒免疫逃逸、免疫紊乱等因素关系颇深[6]。因此，明确在HR-HPV感染的宫颈癌前病变及宫颈癌患者中，阴道微生态环境改变、免疫状态等与病变进展的关系，对早期发现和干预宫颈病变，将宫颈癌的防治“窗口”前移意义重大。

阴道微环境主要由多种微生物菌群、阴道解剖结构、宿主免疫力等多因素动态调节。正常情况下，女性阴道内菌群种类与数量均处于动态平衡状态，尤其是乳酸杆菌作为维持阴道正常微环境的优势菌，对致病菌的清除及肿瘤的抑制具有重要作用，其生长受抑时可导致其他有害菌群过度生长，增加细菌性阴道病(BV)发生风险，而BV是导致HPV感染及持续的主要因素之一[7]。同时，阴道环境中pH值异常与多种致病菌的繁殖有关，且被证实与HPV感染密切相关[8]。本研究发现，HR-HPV感染者阴道微生态环境异常，主要表现为pH降低、清洁度异常、乳酸杆菌减少等，并伴有滴虫、霉菌、线索细胞检出率升高，与陈士华等[9]报道基本相符。李俐等[10]研究亦显示，阴道环境内乳酸杆菌减少均可导致pH值升高、阴道清洁度降低及致病菌数量增加，增加CIN及癌变风险。虽然轻度宫颈炎及HPV感染均有一定自然消退概率，但合并HR-HPV感染的慢性宫颈炎患者进展为宫颈癌变风险较高，文献报道[11]显示，慢性宫颈炎患者发生CIN的概率为正常女性的2～3倍。本研究慢性宫颈炎患者中，pH>4.5、清洁度异常、乳酸杆菌阴性率均高于对照组，考虑为阴道微环境改变所致宫颈阴道部宫颈柱状上皮炎性反应风险增加，故而增加HPV感染及持续的概率；随着宫颈病变进展，pH>4.5、清洁度异常、乳酸杆菌阴性率递增趋势，但仅在CIN Ⅱ/Ⅲ及宫颈癌组较CINⅠ组升高，提示pH>4.5、清洁度异常、乳酸杆菌减少与HR-HPV感染持续及宫颈病变的发生有关，但与CIN的进展及癌变的关系尚需深入研究。Yang等[12]研究显示，阴道微环境改变可活化炎症转录因子，刺激多种炎症因子的持续活化，诱发或加重宫颈组织损伤，进一步增加HR-HPV的易感性及致癌能力。但由于本研究样本量较小，获得的滴虫、霉菌、线索细胞样本少，尚不能确定这些病原菌与HR-HPV感染及CIN的相关性，仍需进一步研究。

局部及全身免疫反应在宿主对抗HPV感染以及抑制宫颈病变进程中均具有积极作用，而逃避宿主免疫是HPV生命周期变化的主要方式之一[13]。T淋巴细胞是机体细胞免疫的主要效应细胞，CD4+T细胞和CD8+T细胞在局部及全身免疫调节中具有关键性作用，其CD4+/CD8+失衡已被证实与多种恶性肿瘤的发生及发展关系密切[14]。本研究显示，HR-HPV感染者CD4+低于正常对照组，且随着宫颈病变加重呈下降趋势，而在组间CD8+未见差异，但CD4+/ CD8+比值呈下降趋势，与Mjb[15]报道基本一致。提示HR-HPV感染可能导致全身细胞免疫功能下降，且随着宫颈病变加重细胞免疫功能越差，且以CD4+T细胞减少为主要表现。

抗原刺激作用下，活化CD4+T细胞可分化产生Th1细胞和Th2细胞，Th1细胞的效应因子主要介导细胞免疫以及移植排斥，故具有抗肿瘤效应的免疫应答作用，其中，IL-2主要刺激肿瘤细胞的凋亡，IFN-γ更侧重于免疫调节，TNF-α可杀伤肿瘤细胞，另一方面还可刺激肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭与转移；Th2细胞的效应因子如IL-4、IL-6、IL-10等可破坏机体免疫系统，促进肿瘤细胞的浸润、转移等[16]。本研究结果显示，在宫颈炎及CINⅠ阶段即具有Th1/Th2细胞因子异常表达，表现为IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均呈过表达，但细胞因子网尚基本维持平衡状态，且CINⅠ与宫颈炎组间未见差异。分析其原因为病变初期Th1细胞可能调动机体免疫系统发挥清除病毒感染及逆转宫颈病变的作用，故而发生“反馈性”升高[17]，亦可能因为本研究样本较小所致。而在CINⅡ开始，IL-2、IFN-γ、TNF-α下降，IL-4、IL-6、IL-10升高，出现明显的Th1/Th2细胞因子失衡，平均IFN-γ/IL-4比值<1，且CIN Ⅲ及宫颈癌组的IL-2、IFN-γ、TNF-α急剧下降，IL-4、IL-6、IL-10持续升高，呈现明显的Th2优势表达，这与大部分研究[18-19]结论一致。由此可见，HR-HPV感染持续过程中，Th2细胞因子产生的负向免疫抑制作用可能高于Th1细胞因子所介导的正向免疫保护作用，由Th1细胞因子过表达所触发的慢性宫颈炎症在CIN Ⅰ阶段开始出现了渐进性演变，在CIN Ⅱ、Ⅲ阶段虽然仍具有活跃的免疫反应但已出现功能失调，Th1/Th2细胞平衡向Th2细胞漂移，导致HR-HPV免疫逃逸，降低机体抗肿瘤免疫应答，增加HR-HPV感染及持续概率，这可能是促进CIN进展至癌变的重要机制[20]。

综上所述，HR-HPV感染者存在阴道微环境改变、T淋巴细胞亚群及Th1/Th2细胞因子表达异常，表现为细胞免疫功能下降、Th1/Th2平衡向Th2细胞漂移，且在宫颈炎到CIN再到宫颈癌变化中，这种变化呈现逐步加重趋势。因此，加强HR-HPV感染者检测力度，密切关注其阴道微环境及免疫状态，这对于宫颈癌前病变及早期宫颈癌预测及治疗有重要意义。但本研究样本尚小，加之阴道微环境、免疫状态的复杂性及宫颈病变影响因素的多样性，尚需深入研究阴道微环境紊乱、免疫状态异常与HR-HPV感染及宫颈病变发生发展关系。