宫颈癌患者血清miR-3607-3p水平与人乳头瘤病毒感染相关性

陈一蕊 勾朝阳 李新阳

河南省南阳市中心医院(473000)

宫颈癌是妇科恶性肿瘤，临床研究发现，宫颈病变程度较高时癌细胞易发生侵袭和转移，患者预后效果差，早期宫颈癌的5年生存率为90%，而晚期的5年生存率仅为25%[1]。高危人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是导致宫颈癌发病的主要原因[2]。宫颈病变主要分为宫颈鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈癌、宫颈柱状上皮异位等，早期临床表现不明显，易导致漏诊而延误治疗的最佳时机[3]。因此，寻找特异度较高的分子标记物，对宫颈癌早期诊治对改善患者预后有重大意义。微小RNAs(miRNAs)具有调控基因，参与机体细胞活动的作用[4]。研究发现，miR-3607-3p在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中表达显著降低[5]。但在宫颈癌中表达的研究目前缺乏。因此，本研究通过分析宫颈癌患者血清中miR-3607-3p表达水平及HPV感染情况及其相关性，为宫颈癌的早期筛查和预后评估提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年8月-2020年2月在本院就诊并行宫颈活检的74例患者临床资料，年龄28～69岁。纳入标准：①符合《2015年NCCN宫颈癌临床实践指南》[6]关于宫颈癌病变诊断标准；②初次行宫颈活体组织检测；③临床资料完整且本人与家属自愿签署知情同意书。排除标准:①合并其他恶性肿瘤及其他脏器功能障碍；②合并其他急性炎症且接受治疗；③合并宫颈手术史且宫颈组织切除。本研究方案经本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒(杭州昊鑫生物科技有限公司)，qRT-PCR检测试剂盒、逆转录试剂盒(上海钰博生物科技有限公司)，引物均由北京伊塔生物科技有限公司合成，HPV E6/E7 mRNA试剂盒(德国贝克曼公司)，LEPGEN qRT-PCR仪(乐普生物科技股份有限公司)，NP80紫外分光光度计(德国implen公司)。

1.3 研究方法

1.3.1样本采集采集研究对象空腹静脉血，静置后离心收集血清，置-18℃保存。

1.3.2qRT-PCR法检测血清中miR-3607-3p水平严格按照说明操作，加入Trizol试剂提取血清中总RNA。将RNA逆转录为cDNA，将所得cDNA为模板进行qRT-PCR反应，以U6为内参基因，采用2-∆∆Ct法计算miR-3607-3p水平。miR-3607-3p及内参U6的引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.3HPV-DNA检测避开经期，使用宫颈专用刷收集宫颈脱落细胞，提取宫颈脱落细胞中DNA，采用PCR扩增技术，利用第二代杂交捕获法对其进行检测，检测高危型HPV 14种，杂交反应期间根据光强弱判断是否存在HPV感染(DNA负荷量<1.0 ng/L为阴性，≥1.0 ng/L为阳性)。

1.3.4HPVE6/E7mRNA检测采用HPV E6/E7 mRNA试剂盒检测所有研究对象宫颈脱落细胞中HPV E6/E7 mRNA表达情况，≥500 copies/ml高载量组，<500 copies/ml低载量组。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料比较

经病理检查为宫颈炎18例(宫颈炎组)，SIL 31例(SIL组)，宫颈癌25例(宫颈癌组)。3组年龄、体质指数(BMI)、分娩次数无差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组一般资料比较

2.2 血清miR-3607-3p水平比较

血清中miR-3607-3p水平宫颈炎组(0.98±0.16)、SIL组(0.64±0.15)、宫颈癌组(0.34±0.13)依次降低(F=100.825，P=0.000)。

2.3 HPV-DNA与HPV E6/E7 mRNA表达比较

宫颈炎组、SIL组、宫颈癌组HPV-DNA与HPV E6/E7 mRNA表达水平依次升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组HPV表达情况比较[例(%)]

2.4 宫颈癌患者血清miR-3607-3p表达与HPV感染的相关性

宫颈癌患者血清中miR-3607-3p高表达7例(28.0%)。Spearman分析显示，宫颈癌患者血清中miR-3607-3p表达与HPV阳性表达、HPV E6/E7 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.541、-0.492，均P=0.000)。

2.5 影响宫颈癌发生的logistic回归分析

以是否发生宫颈癌为因变量(未发生=1、发生=0)，将赋值后的自变量miR-3607-3p、HPV阳性表达、HPV E6/E7 mRNA高载量纳入logistic回归分析。结果显示HPV阳性表达、HPV E6/E7 mRNA高载量是影响宫颈癌发生的危险因素，而miR-3607-3p是宫颈癌发生的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响宫颈癌发生的多因素logistic回归分析

3 讨论

近年来，宫颈癌的发病年龄逐渐趋于年轻化，受到了社会广泛关注。据报道，宫颈癌中80%的病例发生在欠发达国家和发展中国家，我国每年约有10万病例出现[7]。研究发现，HR-HPV持续感染是导致宫颈癌诱发的主要因素，96%以上的宫颈癌患者组织细胞中可以检出HPV，可将其作为宫颈癌早期筛查的重要指标[8-9]。早期宫颈癌患者及时治疗预后较好，而晚期患者则预后较差、死亡率较高。因此，寻找灵敏度和特异度均高且检测方便的生物学标志，是当前预测宫颈癌发病并改善预后的研究重点。

miRNA具有组织特异性、高度保守性和时序性[10]。转录后的miRNA调节靶基因的表达水平，30%转录靶基因受miRNA调控。另外，miRNA参与细胞生长、凋亡、分化和炎症反应等重要生物学过程[11]。有研究发现，miRNA在肿瘤发生发展中担任重要角色，即在不同肿瘤中呈现不同程度的表达，miRNA在实验检测中可反复冻融而含量不被降解，且能长时间保存，这些优点促使miRNA成为未来检测某些肿瘤疾病的一种新型生物标志物[12-13]。miRNA表达改变与宫颈癌的发生发展密切相关[14]。miR-3607-3p是一种位于染色体5q14.3上的内含子miRNA，其表达变化可用于鉴别肿瘤细胞的存在[15]。Wu等[16]研究发现，CirclRAK3海绵miR-3607-3p影响乳腺细胞的侵袭和转移；Sun等[17]研究得出，miR-3607-3p在胰腺癌患者中表达下调，且miR-3607-3p水平与胰腺癌患者预后相关；相关功能实验表明，miR-3607-3p能显著抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[18]。而miR-3607-3p在宫颈癌中的研究鲜有报道，因此本研究探究宫颈癌患者血清中miR-3607-3p的表达水平及其与HPV感染相关性。

本研究结果显示，宫颈炎组、SIL组、宫颈癌组患者血清中miR-3607-3p水平依次降低，提示miR-3607-3p水平与宫颈病变进展有关；宫颈癌组HPV-DNA与HPV E6/E7 mRNA水平高于宫颈炎组和SIL组，进一步提示宫颈癌发生与HPV感染有关。通过Spearman分析，宫颈癌患者血清中miR-3607-3p表达与HPV阳性表达、HPV E6/E7 mRNA水平呈负相关，提示miR-3607-3p可能与HPV感染相互作用，共同影响宫颈癌病情发展，但相互作用机制还有待深入探讨。多因素分析表明，miR-3607-3p低水平、HPV阳性表达、HPV E6/E7 mRNA高载量均是宫颈癌发生的影响因素，均可能使宫颈癌发生风险升高，监控血清miR-3607-3p水平及HPV阳性表达率、HPV E6/E7 mRNA载量有利于宫颈癌的早期筛查及预后评估。

综上所述，宫颈癌患者血清miR-3607-3p水平较低，是宫颈癌发生的影响因素，其与HPV感染呈负相关。检测血清miR-3607-3p水平有助于预测宫颈癌发生，可作为宫颈癌筛查的生物指标。但本研究样本量较少，其具体作用机制尚不明确，研究中可能存在一定误差，后续还需加大样本量继续探讨研究。