胶原蛋白提取及检测方法研究进展

张华 汤振业 赵浩然 储李捺 孙广冬

摘要：目前，随着胶原蛋白在各相关行业中用量不断增加，人们对其的研究愈发重视。胶原蛋白主要存在于水生动物和哺乳动物体内，经专业手段提取后应用于食品、美容、医疗等领域中。本文主要就其提取方法和检测方法展开综述，旨在为今后的相关研究提供有力依据。

关键词：胶原蛋白;提取方法;检测方法

【中图分类号】 G644.5 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）12--01

胶原蛋白主要分布于多细胞生物体内，是其中含量最多且分布最为广泛的蛋白质之一，在蛋白质总量中占比约在25%—35%，是缔结组织的主要组成部分[1]。一般情况下，胶原蛋白提取来自于动物屠宰后的废弃物。此外，鱼皮也是其主要原料之一。胶原蛋白不仅具有良好的理化性能和生物活性，同时还具备其他材料无可比拟的优势，那就是较高的生物相容性和可降解性。正是由于其具备的这些独特优势，使其被大量应用于医药、美容、食品加工等行业中。随着各行各业对胶原蛋白需求量的不断增加，人们对其的研究也在逐步深入。本文主要就胶原蛋白的提取及检测展开综述。

1.胶原蛋白的提取方法

人们主要通过海洋生物和动物组织获得生产胶原蛋白的原材料，包括禽畜骨头、肌腱、猪皮、鱼鳞、鱼皮等。而目前普遍认为品质最佳且污染较小的就是深海鱼胶原蛋白，这也是胶原蛋白提取由动物组织逐渐转向海洋生物的主要原因。下图为酸、酶法结合提取工艺图。

1.1酸法提取

该方法主要通过酸性条件破坏胶原分子间的盐键和Schiff键（一RC=N-）， 引起胶原纤维的膨胀、溶解，从而达到提取的目的。作为溶剂使用的酸主要有乙酸、柠檬酸、甲酸等。用酸法提取的胶原可以最大限度地保持其三股螺旋結构，适用于生物医用材料及其原料。但是酸处理后胶原的溶解量很少。与酶法相比这种方法提取率较低。

1.2酶法提取

酶法具有水解反应快、无环境污染的优点，且提取的水解胶原蛋白纯度高、水溶性好、物理化学性质稳定。胃蛋白酶还可以催化水解胶原的端肽非螺旋区，而对螺旋区无作用，这样溶解的胶原仍具有完整的三股螺旋结构，更降低了胶原的抗原性，适用于生物医用材料及其原料。

1.3盐法提取

常用于提取胶原的中性盐有氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原就会发生溶解。胶原的溶解和分级受中性盐效应的影响，影响机理较为复杂。有的盐可提高胶原的稳定性，有的则可降低其构象的稳定性，不利于天然胶原的提取。

1.4碱法提取

由于碱容易造成肽键的水解，因此得到水解产物的相对分子质量较低。水解过度时，易产生有毒性的D型氨基酸。因此，该方法不适合用于生物医用材料胶原蛋白的提取。

2.胶原蛋白的检测方法

2.1胶原蛋白种类检测

2.1.1傅里叶红外光谱检测法

这种检测方法是基于反射光源所产生的干涉光与分束器融合，从而使其获取样品信息，再利用傅里叶进行转换处理，形成展现透过率、波数、吸收度和波长关系的光谱图，最终明确未知样品中相关物质的分子组成。有学者通过研究发现胶原蛋白螺旋结构、氨基酸序列与酰胺三种带的伸缩振动具有密切相关性。

2.1.2紫外吸收光谱法

胶原蛋白内含的能在紫外吸收光谱中出现吸收峰的不饱和键包括：-CO-NH-、-COOH、C6H6 以及多元芳香环，有学者通过研究提出，大多数蛋白质在230nm波长下和280nm波长处会出现强吸收峰，但对于只含有微量酪氨酸的胶原蛋白而言，却只能在波长低于230nm以下才能出现强吸收，因此，可用其对蛋白质中是否含有胶原蛋白进行判定[2]。有学者特以此为依据，使用多种方法对东方鲀鱼皮进行胶原蛋白提取，结果显示，强吸收峰的出现波长均在235nm左右，同时得出结论，胶原蛋白在利用酶处理后，其紫外吸收能力显著提高，且结构不会发生变化。

2.1.3磷酸缓冲盐溶液和组织化学染色法

磷酸缓冲盐溶液与胶原蛋白融合后，在温度低至4℃条件下会以液态形状出现，在温度升高至38℃时会以固态形状出现，这也是一种判定是否存在胶原蛋白的方法之一。组织化学染色法又包含天狼猩红染色法、V.G染色法以及复合染色法。其中V.G染色法只能用来判定是否存在胶原蛋白，天狼猩红则可对胶原蛋白的种类进行分辨，同时还能测定其含量。而复合染色法可利用胶原蛋白所含的碱性物质与酸性物质发生强烈反应。

2.2胶原蛋白含量检测

2.2.1高效液相色谱法

此法主要借助高压输液系统将各种溶液置入色谱柱，待相关成分处理完成后使用仪器进行检测分析。截至目前，已有相关学者将此方法应用于多种原材料中胶原蛋白含量的测定，包括鸡皮、蛇皮、鲫鱼皮等。

2.2.2紫外分光光度法

紫外分光光度法在检测过程中首先要对样品的吸光度进行测评，随后根据波长与吸光度完成样品的吸收谱图绘制，明确λmax和λmin后，再根据特定的吸收值判定物质含量。如，测定胶原蛋白含量时，要根据其吸光度设置曲线图，在根据样品的吸光度及标准曲线的关系测出具体含量。

2.2.3羟脯氨酸比色法

当胶原蛋白处于强酸或强碱状态下，遇高温溶解后会产生羟脯氨酸，随后以氯胺T氧化羟脯氨酸产生氧化物（内含吡咯环），清除余下物质后，在特定条件下，此氧化物遇到二甲氨基苯甲醛会产生红色物质，并可于558nm处检出，再以标准曲线为依据将羟脯氨酸浓度进行测定，最终得出胶原蛋白具体含量[3]。

3.结语

随着社会及科技的不断发展，胶原蛋白的应用范围愈来愈广。在我国庞大生物资源的支持下，胶原蛋白的提取技术愈发成熟，从一定程度上提升了国内生物资源的利用率。鉴于胶原蛋白的原材料大部分来源于动物屠宰后的废弃物，故而，胶原蛋白的提取对环境改善极为有利。但就目前来看，胶原蛋白的提取与检测依然存在一些急需解决的弊端，包括新产品的研发、应用以及胶原蛋白的纯化问题等。相信在未来的发展中，对胶原蛋白的研究会更加深入，对其的提取和检测方法会愈加先进，胶原蛋白的应用也会愈加广泛。

参考文献：

[1]沈晓丽，闫明俞，耿文宁，李海芳.骨胶原蛋白肽粉中DNA的提取及猪、羊源性成分的检测[J].食品安全质量检测学报，2020，11（03）：945-949.

[2]林丽，薛为长，麦笃萍，唐兰英，李明珍.鱼皮胶原蛋白的提取与检测研究综述[J].内江科技，2019，40（07）：94-95.

[3]卢韵君. 鱼源胶原蛋白肽酶解工艺及其分子量检测方法研究[D].华南理工大学，2016.